Approche transcriptomique de la compétence ovocytaire chez la poule

Abstract

The reproductive physiology of the hen shows numerous specificities that include oviparity and telolecithe oocyte. The chicken embryonic genome reactivation occurs when the embryo contains 30,000-50,000 cells. Proteins and mRNA accumulated during chicken oocyte maturation are essential not only for fertilization and first cleavages but also for supporting such a high number of embryonic cell divisions. This leads to investigate the regulation of the expression and function of chicken genes involved in the maturation of the oocyte, with consequences on the development of the early embryo. First we used a double approach, in silico and microarray to obtain a list of potentially avian oocyte-specific genes. An in silico work was used to find avian ortholog genes of murin oocyte-specific genes, using blast. The microarray approach let us find a list of 460 genes expressed in granulosa cells and a list of 250 genes expressed in the oocyte. Genes identifies by the 2 approach were compared and 23 candidate genes were further investigated as bmp15, gdf9,chk mos, msh4, btg4, cvh, zp1, zpA, zpC, dazl. Eleven of these genes were specifically expressed in the hen ovary as gdf-9, chkmos, dazl, zpA, zpC, cvh, mos, btg4, f box and 6 are preferentially expressed in the ovary as bmp 15, zar 1, mcmip, msh4, ktfn et fox L2. Temporal expression of each gene was analysed during follicular maturation and early embryo development. All these data were used to realize a hierarchical classification of genes and to define cluster of expression. Those genes are implicated in follicular maturation, in meiotic maturation, in fertilization process, in early embryo development and for some of them in embryo development happening after the activation of the embryonic genome. A functional study on 1 of these gene, bmp15, also revealed an inhibitory effect of BMP15 on steroidogenesis of granulosa cells in the hen.We then used microarray on hens exhibiting difference in fertility rate in order to identify genes whose expression level is correlated with fertility. Four hens lines divergently selected were used, and animals exhibiting the most important difference where chosen. The transcriptomic approach enabled us t identify 54 et 84 genes differentially expressed between DPF lines or HG/LG lines, divergently selected on the duration of fertile periode (DPF) or on the growth rate (HG/LG). Fifteen genes differentially expressed were chosen to be studied in an individual study during follicular maturation and early embryo development. We found 3 genes whose eeexpression level was correlated with fertility rate. This work is a step of understanding the genes and their functions implicated in oocyte maturation or early embryo development and also and genes related to fertiliy.Ce travail a pour but de mieux connaître l impact de la qualité de l ovocyte sur le succès de la reproduction chez la poule. Pour cela, nous avons entrepris l étude des gènes impliqués dans la compétence ovocytaire à la fécondation et au développement précoce de l embryon. Cette étude s appuie sur les connaissances acquises sur ces processus chez les mammifères, sur les données du séquençage et de la cartographie du génome du poulet, ainsi que sur les bases de données riches en EST de poulet. Chez les oiseaux, les premières divisions embryonnaires se produisent dans le tractus génital femelle. Les réserves en protéines et ARNm accumulées pendant la folliculogénèse dans l ovocyte assurent le début du développement embryonnaire avant que l activation du génome embryonnaire ne rende celui ci fonctionnel (24 heures après la fécondation soit au moment de la ponte), à ce stade l embryon a cependant déjà 30 à 50 000 cellules.Dans un premier temps, nous avons utilisé une double approche in silico et microarray afin d obtenir une liste de gènes aviaires potentiellement spécifiques de l ovocyte. Un travail de bioinformatique a permis grâce à des alignements de séquences, de rechercher les gènes aviaires orthologues de gènes murins spécifiquement exprimés dans l ovocyte. L approche microarray a permis de générer une liste de 460 gènes exprimés dans la granulosa et de 250 gènes exprimés dans l ovocyte. Les gènes identifiés par les 2 approches, microarray et bioinformatique, ont été comparés, puis 23 gènes candidats, dont bmp15, gdf9,chk mos, msh4, btg4, cvh, zp1, zpA, zpC, dazl, ont été retenus pour la suite de l étude. Onze gènes sont exprimés spécifiquement dans l ovaire de poule comme gdf-9, chkmos, dazl, zpA, zpC, cvh, mos, btg4, f box et 6 gènes sont exprimés préférentiellement dans l ovaire comme bmp 15, zar 1, mcmip, msh4, ktfn et fox L2. Des cinétiques d expression ont ensuite été réalisées au cours de la maturation folliculaire et du développement précoce pour chaque gène. L ensemble de ces données a permis de faire une classification hiérarchique des gènes et de les regrouper en clusters en fonction de leur cinétique d expression et donc en fonction de la période où ils agissent. Ces gènes sont impliqués dans la maturation folliculaire des ovocytes, dans leur maturation méiotique, dans la fécondation, le développement embryonnaire précoce et également, pour certains, dans le développement embryonnaire après l activation du génome embryonnaire. Une étude fonctionnelle d un de ces gènes, bmp15, a également montré son effet inhibiteur dans la stéroïdogénèse sur les cellules de granulosa de poule.Dans un deuxième temps, nous avons utilisé une approche microarray sur des ovocytes provenant d individus présentant des différences de fertilité, et ce afin d identifier des gènes dont l expression soit corrélée à la fertilité. Quatre lignées divergentes ont été retenues, et à l intérieur de ces lignées nous avons sélectionné les individus présentant les différences de fertilité les plus importantes. L approche microarray a permis d identifier 54 et 84 gènes différentiellement exprimés en fonction des lignées étudiées DPF ou HG/LG divergeant sur la durée de période fertile (DPF) ou sur la vitesse de croissance (HG/LG). Quinze gènes différentiellement exprimés ont été sélectionnés pour une étude individuelle au cours de la maturation folliculaire tardive et du développement embryonnaire précoce. Grâce à ce travail nous avons identifié 3 gènes dont l expression est corrélée à la fertilité.Ce travail a permis d acquérir des connaissances sur les gènes impliqués à différentes étapes de la maturation ovocytaire ou du développement embryonnaire précoce, et également sur des gènes influençant la fertilité. Etudiés chez une espèce cible d intérêt agronomique, la poule, ils ouvrent des perspectives scientifiques vers l approfondissement des connaissances de la fonction de ces gènes.TOURS-BU Sciences Pharmacie (372612104) / SudocSudocFranceF