Synthèse de nouveaux agents chimiques pour la détermination de structures tridimensionnelles à basse résolution de protéines

Abstract

La détermination de structures tridimensionnelles des protéines est essentielle à l'étude de leur fonction in vivo. Des stratégies alternatives à l'utilisation de méthodes d'analyse à haute résolution ont été développées dans le but de lever certaines contraintes (e.g. nécessité de quantités de protéines pures cristallisées importantes pour réaliser des expériences de diffraction des rayons X). Ces méthodes sont basées sur l'utilisation conjointe d'agents chimiques de modification de protéines et de l'analyse par spectrométrie de masse. Elles permettent d'obtenir efficacement des données structurales variées (e.g. accessibilité au solvant, contraintes de distances, sites de modifications post-traductionnelles) basse résolution. La difficulté majeure à l'obtention de ces données reste cependant la détection de peptides d'intérêt faiblement représentés dans un mélange complexe. Trois projets ont été initiés durant ces travaux de thèse dans le but d'améliorer cette détection en spectrométrie de masse afin de fournir plus rapidement des données structurales. - Le projet 1 a permis de mettre au point une nouvelle méthode utilisant conjointement un marqueur UV-absorbant dérivé de l'acide -cyano-4-hydroxycinnamique (HCCA) et une matrice MALDI adaptée. Un effet important de discrimination spectrale a été obtenu, permettant la détection de peptides d'intérêt en spectrométrie de masse MALDI-TOF. Plusieurs nouveaux agents chimiques mono et bifonctionnels ont été synthétisés et utilisés pour l'étude d'accessibilité au solvant et pour mesurer des contraintes de distances au sein de protéines modèles. - Lors du projet 2, une nouvelle stratégie d'extraction de peptides d'intérêt issus de la digestion enzymatique d'une protéine immobilisée a été développée. Elle repose sur l'utilisation de supports solides portant différents agents chimiques mono et bifonctionnels. - Le projet 3 a permis de développer de nouveaux agents chimiques possédant un motif UV-absorbant dérivé afin de faciliter la détermination des sites de phosphorylation par analyse spectrométrique de masse de type MALDI-TOFThe three-dimensional structure determination is essential for understanding biological functions of proteins. Alternative strategies to X-Ray crystallography and NMR have been developed to avoid some constraints (e.g. the need of a large quantity of pure crystallized protein). These strategies are based on the use of chemical reagents for protein modification followed by mass spectrometry analysis providing efficient low-resolution protein structure data (e.g. solvent accessibility, distance constraints, position of post-translational modifications). However, the main difficulty to provide these data is the detection of low concentration of peptides of interest in a complex mixture. During this PhD study, three projects have been initiated to improve this detection by mass spectrometry. - Project 1 provided a new method using a light-absorbing label derived of -cyano-4-hydroxycinnamic acid and a suitable MALDI matrix. A significant spectral discrimination effect was obtained, enabling detection of peptides of interest by MALDI-TOF mass spectrometry. New mono and bifunctional chemical reagents were synthesized and used for the study of solvent accessibility and to measure constraint distances in two model proteins. - During the project 2, a new strategy to isolate peptides of interest after enzymatic digestion of a protein captured on resin beads was developped. This method relies on the use of solid supports loaded by different mono and bifunctional chemical reagents. - In the project 3, new chemical reagents bearing a light-absorbing label were synthesized to facilitate determination of phosphorylation sites by MALDI-TOF mass spectrometryMONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF