Molecular mechanisms of trafficking and signalling of V1b and V2 vasopressin receptors

Abstract

Mécanismes moléculaires de la signalisation et du trafic des récepteurs V1b et V2 de la vasopressine L'arginine-vasopressine (AVP) est une hormone neurohypophysaire induisant la libération d'ACTH des cellules corticotropes pituitaires et un effet rénal antidiurétique via respectivement les récepteurs V1b et V2 (V1bR et V2R). Peu de choses sont connues concernant les mécanismes moléculaires de la signalisation et du trafic du V1bR. Parallèlement, le fonctionnement du V2R est bien mieux décrit. Cependant, d'un point de vue physiopathologique, la plupart des mutations naturelles du V2R conduisent à la rétention intracellulaire du récepteur qui devient incapable d'interagir avec l'AVP et promouvoir la réabsorption d'eau. Cette rétention conduit à une maladie rénale, le diabète insipide néphrogénique congénital (DINc). De nouvelles stratégies thérapeutiques focalisées sur le trafic des récepteurs séquestrés doivent donc être développées. Dans une partie plus fondamentale, nous avons étudié les mécanismes moléculaires impliqués dans la signalisation et le trafic du récepteur V1b tels qu'internalisation, recyclage et désensibilisation. Nous avons démontré en utilisant des cellules KO pour les arrestines, qu'après activation par l'AVP, V1bR internalise fortement dans la cellule par un mécanisme arrestine-dépendant. En utilisant une approche biophysique de BRET, nous avons corroboré ces résultats par la visualisation d'une interaction directe récepteur-arrestine AVP-dépendante impliquant principalement la partie C-terminale du récepteur. Les substitutions des sérines 368, 371, 373, 374 de l'extrêmité C-terminale en alanines (sites putatifs pour GRK) n'affectent pas les processi d'internalization/recyclage du V1b-R, ni son interaction avec l'arrestine. Des chimères V1bR-V2R formées par échange de leurs séquences C-terminales nous ont permis de corréler une interaction faible et transitoire du V1bR et de l'arrestine avec son recyclage rapide (récepteur de classe A), ainsi qu'une interaction forte et prolongée du V2R avec l'arrestine et son recyclage lent (récepteur de classe B). Contrairement au phénomène d'internalisation, le processus de désensibilisation ne semble pas impliquer la partie C-terminale du récepteur V1b, ni la proline 9 de la boucle i2 du récepteur car des modifications de ces 2 domaines n'affectent pas ce processus. De plus, la désensibilisation peut se produire en l'absence d'internalisation. La désensibilisation et l'internalisation du récepteur V1b semblent constituer deux phénomènes indépendants. Nous avons aussi démontré que le V1bR pouvait former non seulement des homodimères mais aussi des hétérodimères avec V2R. Dans l'hétérodimère, l'AVP et l'agoniste sélectif du V1bR humain d[Cha4]AVP produisent des effets différents vis-à-vis de l'interaction récepteur-arrestine et d'une augmentation de calcium, nous conduisant à déduire que la voie Ca2+ nécessiterait l'activation d'un seul protomère alors que le recrutement de l'arrestine nécessiterait l'activation des deux. De plus, V1bR interagit non seulement avec Gq mais aussi avec Gs, selon la nature du ligand et de la localisation du récepteur dans des compartiments spécialisés de la membrane plasmique. En vue d'une application thérapeutique potentielle pour le DINc, nous avons pu développer et caractériser de nouveaux agonistes pharmacochaperones capables de rapatrier et activer certains mutants DINc du V2R. De plus, ces agonistes de la voie Gs sont des ligands biaisés puisqu'ils sont antagonistes de la voie arrestine. Ces nouvelles pharmacochaperones agonistes biaisées permettant une durée d'action potentielle plus longue, offrent de nouvelles perspectives pour les patients atteints de DINc.Molecular mechanisms of trafficking and signalling of V1b and V2 vasopressin receptors Arginine-vasopressin (AVP) is a neurohypophysial hormone inducing ACTH release from corticotroph cells in the pituitary and antidiuretic effect in the kidney via the V1b and V2 receptors (V1bR and V2R), respectively. Little is known on molecular mechanisms mediating V1bR trafficking and signalling. In parallel, much more information is available about V2R functioning. Nevertheless, from a pathophysiological point of view, most of the natural V2R mutations lead to intracellular retention of the receptor which is unable to interact with AVP and promote water reabsorption, leading to the congenital nephrogenic diabetes insipidus (cNDI) renal disease. New therapeutic strategies focused on trafficking of the sequestered mutants must be developed. In a more fundamental part, we studied the molecular mechanisms implicated in the signalling and trafficking of the V1bR such as internalization, recycling and desensitization. We demonstrated using arrestin KO cells that under AVP stimulation, V1bR strongly internalizes into the cells by an arrestin-dependent mechanism. Using BRET biophysical approach, we corroborated these results by demonstrating a specific AVP-induced direct V1bR-arrestin interaction which involves principally the V1bR C-terminus. Alanine substitutions of the C-terminal serines 368, 371, 373, 374 corresponding to putative GRK sites, did not affect the internalization/recycling processes of V1bR nor its interaction with arrestin. Chimeric V1b-V2 receptors for which the C-termini have been exchanged, allowed us to correlate a weak, transient interaction with arrestin to the rapid recycling of V1bR (class A receptors), and a strong, long-lasting arrestin interaction with the slow recycling of V2R (class B receptors). On the contrary, nor the C-terminal part of V1bR, neither proline 9 in i2 loop were involved in desensitization since modifications in these two domains did not affect this process. Moreover, desensitization occurs in the absence of internalization. V1bR internalization and desensitization constitute two independent processes. Subsequently, we demonstrated that V1bR is able to form not only homodimers but also heterodimers with V2R. Upon binding to the heterodimer, AVP and the selective hV1bR agonist d[Cha4]AVP have different outcomes on receptor-arrestin interaction and Ca2+ release, suggesting that V1bR-induced Ca2+ increase could need only one activated protomer whereas arrestin recruitment would need two. Moreover, V1bR was shown to signal through Gq and interestingly also through Gs protein, depending on the nature of the ligand and on the receptor localization within specialized compartments of the plasma membrane. Having in mind a potential therapeutic application for cNDI, we were able to develop and characterize new agonist pharmacochaperones able to rescue and activate a set of cNDI mutants of the V2R. Moreover, we demonstrated their biased character, consisting in arrestin-related antagonistic properties. These biased pharmacochaperones ligands having a potential long-lasting antidiuretic effect, offer new perspectives for cNDI patients.MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF