Etude de la modulation de la traduction du virus de l'hépatite C par des facteurs viraux en cis et en trans et développement de nouveaux outils via le système lentiviral

Abstract

Le virus de l hépatite C (VHC) est actuellement responsable d un problème de santé mondiale infectant environ 3% de la population. Le VHC possède une molécule d ARN simple brin et de polarité positive ainsi que deux régions non codantes (NC) 5 et 3 . La traduction virale a lieu via une séquence interne d entrée des ribosomes (IRES) située dans la région 5 NC. L objectif de ce travail de thèse a été de clarifier le rôle de facteurs viraux en cis (3 NC) et en trans (C, NS5A, NS5B) dans la régulation de l activité traductionnelle de l IRES. Nous avons utilisé un système double rapporteur ARN, ciblant ainsi la traduction. D après l activité relative de l IRES mesurée (rapport RLuc/FLuc) différents points ont été observés : 1) la région 3 NC stimule fortement l activité IRES en cis, ce qui dépend de la structure secondaire globale; 2) une modulation dose et génotype dépendante de la traduction a été démontrée en présence de C et NS5B ; 3) aucun effet synergique n a été observé entre les protéines virales ou entre les différents facteurs viraux. D après ces résultats, les facteurs viraux étudiés agiraient de façon séquentielle pour moduler la traduction virale. Nous nous sommes ensuite focalisés sur le développement de nouveaux outils. Nous avons établi un système lentiviral bicistronique, qui s est révélé efficace pour le criblage de drogues. Les expériences actuellement en cours visent l établissement d une lignée exprimant constitutivement l ARN polymérase du phage T7 (T7 RNAp), permettant à la fois une analyse fine de la fonctionnalité de l IRES, le criblage de drogues ainsi que l étude d autres virus, remplaçant le système vaccine couramment utilisé.Hepatitis C virus (HCV) is responsible of a major health problem, infecting 3% of world population. Hepatitis C Virus (HCV) possesses a positive single-stranded RNA genome with highly structured non coding (NC) regions at its extremities: 5 NC and 3 NC. Translation initiation of HCV RNA occurs via an Internal Ribosome Entry Site (IRES) located at its 5 end. Our aim was to clarify the role of cis (3 NCR) and trans (C, NS5A, NS5B) viral factors on the regulation of IRES activity. By the use of a dual RNA reporter system, targeting the translation step and avoiding the cryptic IRES promoter activity, relative IRES activities measured in luminometry (= RLuc/FLuc activities ratio) revealed the following features : 1) all the HCV 3 non coding (NC) sequences tested highly stimulate in cis the IRES efficiency; 2) a dose and genotype dependent modulation of the translation in trans was shown with the capsid and NS5B ; and 3) not any cooperative effect could be obtained either between viral proteins, or in the presence of both cis and trans factors. Taking together these results encouraged us to propose a model in which the viral factors tested act sequentially to modulate viral translation and the switch to replication. We then focus on the development of novel tools for evaluating the IRES activity analysis. We established a bicistronic lentiviral system, which revealed efficient for drugs screening, however not adequate for a precise IRES activity analysis. Experiments actually in progress aim the precise analysis of IRES activity, drugs screening and in addition the study of other viruses, replacing the vaccine system currently used.PARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF