La réponse des cellules gliales de Müller à l'amyloïde-b et au stress oxydant dans la dégénérescence rétinienne

Abstract

La dégénérescence maculaire liée à l âge ou DMLA est une pathologie oculaire qui touche près d un million de personnes en France, et représente la première cause de cécité légale dans les pays industrialisés. C est une affection multifactorielle (environnement, génétique), dans laquelle les stress inflammatoires, métaboliques et oxydants interviennent et aboutissent à la mort des photorécepteurs. L apparition des drusen (dépôts de matériel extracellulaire contenant de l amyloïde-b (Ab)), entre les cellules de l épithélium pigmentaire de la rétine (EPR) et la membrane de Brush, représente un facteur de risque de développement de la DMLA. De plus, le 4-hydroxynonenal (4-HNE) est un marqueur de stress oxydant dans la rétine de patients de différentes pathologies dégénératives comme la DLMA. L identification des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans les dégénérescences rétiniennes la pathogenèse de la DMLA constitue un enjeu de santé publique, puisqu elle permettrait de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques anti-dégénératives.Le but de mon travail de thèse a été dans un premier temps de mieux comprendre le rôle de l Ab dans la dégénérescence rétinienne.Nous avons montré que l Ab induit une activation rapide des cellules microgliales, une gliose soutenue des cellules gliales de Müller (CGM), un œdème dans la rétine interne et une apoptose des photorécepteurs. La dégénérescence des photorécepteurs est en corrélation avec une activation soutenue de PERK, impliquée dans la voie pro-apoptotique de la réponse UPR. Par ailleurs la gliose des CGM est caractérisé par une délocalisation des canaux Kir4.1, une diminution de l expression d AQP4 et de la glutamine synthetase (GS), et une augmentation de l expression des canaux Kir2.1 et du transporteur GLAST1, suggérant une dérégulation de l homéostasie rétinienne contrôlée par ces protéines. Nous avons montré que l inhibition de la réponse inflammatoire, par l utilisation de l indomethacine, un inhibiteur non stéroïdien de de la cyclooxygénase (COX) 2, réverse l effet de l Ab sur l expression des canaux Kir4.1 et sur GLAST1 mais pas celle de la GS et d AQP4, suggérant un couplage partiel entre la gliose et la réponse inflammatoire dans notre modèle d injection sous-rétinienne d Ab.Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés au rôle du 4-HNE dans les CGM, un produit de peroxydation lipidique, qui est produit dans la rétine sous l effet de l Ab. Nous avons observé qu un stress oxydant unique et létal induit par le 4-HNE, entraîne la mort des CGM par apoptose dépendante de l activation des caspases. L utilisation d antioxydants impliqués dans la régénération du glutathion (GSH), protège contre la mort des CGM. L analyse du transcriptome des CGM soumises au 4-HNE a permis de mettre en évidence une réponse transcriptionnelle adaptative des CGM : une activation de la défense anti-oxydante, de la réponse UPR (unfolded protein response) au stress du réticulum endoplasmique, et un phénotype anti-inflammatoire. Par ailleurs, la surexpression de l APP (amyloid protein precursor), dont l expression du transcrit est augmentée sous l effet du stress oxydant dans les CGM, protège ces cellules contre la mort induite par le 4-HNE. Cette protection est associée à une augmentation des capacités anti-oxydantes et à une activation de la voie de survie de la réponse UPR. L ensemble de nos résultats montre un rôle de l Ab dans la dégénérescence des photorécepteurs et indique que le métabolisme de l APP, ainsi que les voies de survie et pro-apoptotique de la réponse UPR pourraient constituer des cibles thérapeutiques contre la dégénérescence rétinienne induite par l Ab ou les stress oxydants.Age related macular degeneration (AMD) is a leading cause of blindness in western countries and affects one million people in France. Multiple risk factors (genetics, environment) are involved in the pathogenesis of AMD. In addition, the AMD pathogenesis is strongly associated with chronic oxidative stress and inflammation that ultimately lead to photoreceptor death. AMD is characterized by the formation of drusen, extracellular deposits, including amyloid-b (Ab), between the retinal pigmented epithelium and Bruch s membrane. Moreover, 4-hydroxynonenal (4-HNE) is an oxidative stress marker of different retinal diseases including AMD. The determination of molecular and cell mechanisms involved in retinal degeneration and the pathogenesis of AMD is required in order to develop new therapeutic anti-degenerative approaches. The aim of our study was first to investigate the role of Ab in retinal degeneration. We demonstrated that subretinal injection of Ab induces an early activation of microglial cells, a sustained retinal Müller glial (RMG) cells gliosis, an oedema in the internal part of retina and photoreceptors apoptosis. The photoreceptors apoptosis was correlated with a sustained activation of PERK, a kinase implicated in the pro-apoptotic pathway of UPR (unfolded protein response). In addition, RMG gliosis has been characterized by a Kir4.1 channel redistribution, a down-regulation of AQP4 and glutamine synthetase (GS) expression, and an up-regulation of Kir2.1 channel and GLAST1 transporter expression, suggesting a dysregulation of the retinal homeostasis which is controlled by these proteins. The inhibition of the inflammatory response using indomethacin, a non-steroidal and non-specific cyclooxygenase (COX) 2 inhibitor, reversed Ab-induced Kir4.1 channel redistribution and GLAST1 up-regulation but not GS and AQP4 down-regulation, suggesting a partial coupling between gliosis and inflammatory response in retinal degeneration after subretinal injection of Ab in mice. The second part of our study aimed to investigate the effects on RMG cells of 4-HNE, a lipid peroxidation product that is up-regulated in retina after Ab injection. We have shown that a single lethal oxidative stress using 4-HNE induces RMG cells apoptosis associated with caspase 3 and caspase 9 activation. Pre-treatment of RMG cells with anti-oxidative molecules involved in glutathione regeneration restored cell viability. Transcriptome analysis of RMG cells treated with 4-HNE showed an adaptive transcriptional response consisting in an activation of anti-oxidative stress cell defense, activation of UPR in response to endoplasmic reticulum stress and anti-inflammatory phenotype. APP (amyloid protein precursor) overexpression, which the transcript is up-regulated in RMG cells under oxidative stress, protects from 4-HNE-induced cell death. This protection is associated with an up-regulation of anti-oxidative cell defense and an activation of the pro-survival pathway of UPR. Our study pinpoints the role of Ab in photoreceptors degeneration and suggests that targeting APP metabolism, pro and anti-apoptotic pathways of the UPR response may hel develop selective methods against retinal degeneration implicating Ab and oxidative stress.PARIS5-Bibliotheque electronique (751069902) / SudocSudocFranceF