Partie I, Étude structure-fonction de TBP dans les fibroblastes murins (Partie II, Étude de l action de l acide rétinoïque dans la différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires)

Abstract

Partie 1 : étude structure-fonction de la TBP (TATA Binding Protein) dans les fibroblastes murins. Le domaine C-terminal conservé de la TBP interagit avec de multiples partenaires pour former des complexes nécessaires à la transcription par les ARN polymérases I, II et III. Pour analyser ces interactions dans les cellules de mammifères, nous avons utilisé des fibroblastes embryonnaires murins modifiés génétiquement. Dans ces cellules, la TBP endogène peut être remplacée par une TBP exogène sauvage ou portant des mutations (substitution d un seul acide aminé dans le domaine C-terminal). Nous avons montré que de nombreux mutants de TBP peuvent complémenter la perte de la TBP endogène, mais provoquent une baisse de la prolifération. Des expériences d immunoprécipitation couplées à des analyses par spectrométrie de masse ont permis d identifier deux mutations, R188E et K243E, qui affectent l'interaction TBP/BTAF1 et la formation du complexe B-TFIID. L'analyse du transcriptome montre que la mutation R188E affecte l'expression de seulement 474 gènes. En accord avec ces résultats, l'analyse par ChIP-seq montre que cette mutation n a pas d effet général sur la distribution de TBP et de la Pol II dans le génome, mais perturbe le fonctionnement d un nombre réduit de promoteurs par des mécanismes différents. Sur certains promoteurs, la mutation affecte le recrutement de TBP, alors que sur d autres, elle induit le remplacement de B-TFIID par TFIID, ce qui se traduit par le recrutement de la Pol II et l activation du promoteur. Ces données montrent que le complexe B-TFIID n'est pas essentiel pour la viabilité cellulaire, mais il est nécessaire à une prolifération normale. Ces données montrent également que B-TFIID n est pas un régulateur global de la transcription, mais régule spécifiquement un ensemble réduit de gènes. Partie 2 : étude de l action de l acide rétinoïque dans la différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires. Les cellules souches embryonnaires murines (ES) se différencient en neurones pyramidaux glutaminergiques in vitro suite au traitement par l acide rétinoïque (AR). Nous avons utilisé la technique de RNA-seq pour identifier les gènes dont l expression est modifiée après le traitement par l AR durant la différenciation neuronale. Nous avons ainsi pu établir des profils d expression génique qui caractérisent chaque stade de ce processus. Plusieurs facteurs de transcription font partie des gènes régulés par l AR. Parmi ces facteurs se trouve notamment HES3 (Hairy and Enhancer of Split). Afin de mieux comprendre la fonction de ce facteur, nous avons réprimé son expression dans les cellules ES par la technique de shRNA. La perte d expression de HES3 n affecte pas la réponse précoce à l AR, ni l initiation de la différenciation. Nos résultats indiquent que HES3 agit à une étape plus tardive où il est essentiel à l expression des marqueurs neurogéniques Brn2 et Mapt. Ces observations suggèrent que HES3 est nécessaire à la différenciation neuronale des cellules ES in vitro.Part 1 : structure-function analysis of TBP in murine embryonic fibroblasts. The conserved C-terminal domain of the TATA binding protein (TBP) interacts with multiple partners to form several complexes required for transcription by RNA Polymerases I, II and III. To analyse these interactions in mammalian cells we used genetically modified mouse embryonic fibroblasts where endogenous TBP can be replaced by an exogenous wild-type or mutant TBP with a single aminoacid substitution in the C-terminal domain. We show that many TBP mutants can complement loss of the endogenous TBP, but induce a slow growth phenotype. Tandem immunopurifications and mass-spectrometry analysis identify two TBP mutations, R188E and K243E, that completely disrupt the TBP/BTAF1 interaction and formation of the B-TFIID complex. Transcriptome analysis shows that the R188E mutation affects the expression of only 474 genes. In agreement with this, ChIP-seq analysis does not show major changes in genomic TBP and Pol II distribution in cells expressing TBPR188E. However, at affected promoters, mutations in TBP result either in its de novo recruitment or in an exchange of the B-TFIID by TFIID, thus promoting Pol II recruitment and gene activation in R188E mutant cells. These data show that B-TFIID complex is not essential for cell viability, but is required for normal proliferation. The B-TFIID is required for regulation of only a small subset of genes. Part 2 : study of the role of retinoic acid in neuronal differentiation of embryonic stem cells.Mouse embryonic stem cells (ES) can be differentiated into glutamatergic pyramidal neurons in vitro following retinoic acid (RA) treatment. We used RNA-seq to identify genes that are deregulated after RA treatment during neuronal differentiation. We established gene expression profiles that characterize each stage of this process. Several transcription factors are regulated by RA. HES3 (Hairy and Enhancer of split) is one of the most upregulated genes. To better understand its function, we repressed its expression using shRNA. The loss of HES3 expression does not affect the early RA response nor the initiation of differentiation. Our results indicate that HES3 acts at a later stage where it is essential for Brn2 and Mapt neurogenic markers expression. These observations suggest that HES3 is essential for neuronal differentiation of ES cells in vitro.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF