Rôle de la L-plastine dans l'assemblage du cytosquelette cortical d'actine et la progression des cellules tumorales

Abstract

L'organisation du cytosquelette d'actine en réseaux et en faisceaux est contrôlée par une multitude de protéines structurales. La modification de ces protéines contribue à des pathologies telles que le cancer où des changements structuraux et fonctionnels du cytosquelette d'actine induisant la progression et la transmission de signaux cellulaires dérégulées. Ce travail de thèse se concentre sur l étude du rôle de la L-plastine dans l'assemblage du cytosquelette cortical d actine et dans la progression des cellules tumorales.La L-plastine appartient à une grande famille de protéines de pontage de l actine qui contribue à l'invasion des cellules tumorales d'une façon phosphorylation-dépendante. La L-plastine est localisée au niveau de structures d actine membranaires impliquées dans la locomotion, l'adhésion et la défense immunitaire. Ici, nous avons étudié la dynamique de la L-plastine/actine dans les cellules vivantes en combinant la méthode de rétablissement de fluorescence après photoblanchissement (FRAP) avec la modélisation mathématique. Nous avons démontré quantitativement que la phosphorylation de la L-plastine au niveau de son résidu Ser5 augmente sa capacité d interagir avec l actine influençant de ce fait sa localisation intracellulaire. D'autre part, nos résultats ont montré que la L-plastine fixe et stabilise le cytosquelette d'actine et affecte la dynamique de l actine d'une façon phosphorylation-dépendante. Conformément au rôle de la L-plastine dans le contrôle de la dynamique de l'actine, nos résultats ont prouvé que le traitement au PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate), par l intermédiaire de la PKC, favorise la localisation de la L-plastine au niveau des protrusions membranaires et augmente sa phosphorylation au niveau du résidu Ser5 dans les cellules de cancer du sein MCF-7. Il est intéressant de noter que nos résultats indiquent qu une des isozymes de PKC d et/ou e semblent être impliquées dans la phosphorylation de la L-plastine dans les cellules cancéreuses.En utilisant des approches de biochimie, nous avons étayé la contribution de la L-plastine sur la régulation dynamique de l'actine, en illustrant son association avec un complexe protéique contenant la cortactine. Enfin, nous avons démontré la colocalisation de la L-plastine avec des marqueurs des invadosomes, et nous avons identifié un nouveau rôle phosphorylation-dépendant de la L-plastine dans la résistance à la mort cellulaire provoquée par le facteur de nécrose tumorale-alpha (TNF-a), consolidant le rôle de la L-plastine dans la progression des cellules tumorales.The overall organisation of the actin cytoskeleton into networks and bundles is controlled by a plethora of actin-binding proteins. Functional alteration of these actin-binding proteins contributes to pathologies such as cancer where structural and functional modifications of the actin cytoskeleton are linked to uncontrolled cell movement and signalling. This thesis focuses on the study of the role of L-plastin, an actin crosslinking protein, in the assembly of the cortical cytoskeleton and the progression of cancer cells. L-plastin is an actin filament bundling protein which contributes to cancer cell invasion in a phosphorylation-dependent manner. L-plastin localises to actin-rich membrane structures involved in locomotion, adhesion and immune defense. In this work, we have investigated L-plastin/actin dynamics in live cells by combining confocal microscopy-based fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) method with mathematical modelling. We show that phosphorylation of L-plastin on residue Ser5 increases its association rate and may thereby influence its intracellular localisation and promote its capacity to dock efficiently to the actin cytoskeleton. Importantly, we provide evidence for the first time that L-plastin modulates actin dynamics and turn-over in focal adhesions and stress fibers, increasing their F-actin content by decreasing the actin dissociation rate at actin filament ends, effects which are also enhanced by Ser5 phosphorylation. Consistent with the L-plastin role in the control of actin dynamics, our data provide evidence that Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) treatment, through activation of PKC, induces the translocation of L-plastin to de novo actin polymerisation sites in ruffling membranes and protruding spikes and significantly enhances L-plastin phosphorylation on residue Ser5 in the breast cancer cell line MCF-7. Interestingly, our results point to an important role for novel PKC isozymes (d and/or e) in regulating L-plastin phosphorylation in cancer cells. Using biochemical experiments, we further substantiate the contribution of L-plastin to actin dynamics regulation by illustrating its association with a protein complex containing the Arp2/3-complex activating protein cortactin. Finally, we provide evidence for the colocalisation of L-plastin with well characterised markers of podosomes and invadopodia, and we identified a novel phosphorylation-dependent function for L-plastin in conferring resistance to the cytotoxic effect of tumour necrosis factor-alpha (TNF-a), further supporting the role of L-plastin in cancer progression.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF