Pathogénie intracellulaire des staphylococcus aureus hypervirulents (rôle des phénol-soluble modulins, de l'alpha-toxine et de la beta-toxine dans l'échappement phagosomal et l'induction de l'autophagie)

Abstract

Staphylococcus aureus est un pathogène intracellulaire facultatif capable d'envahir les cellules eucaryotes et d'induire leur mort. Cette virulence intracellulaire ou cytotoxicité a été associée à deux phénomènes, l'échappement phagosomal (destruction de la vacuole d'internalisation et relargage de bactéries libres dans le cytoplasme) et le détournement de l'autophagie (séquestration de S. aureus dans un autophagosome, blocage de la fusion lysosomale et réplication bactérienne intra-autophagosomale ). Les connaissances sur ces phénomènes intracellulaires sont limitées et comportent plusieurs résultats contradictoires: (i) l'expression d'alpha-toxine par S. aureus semble associée au détournement de l'autophagie mais pas à la cytotoxicité, (ii) l'expression des phenol-soluble modulins (PSM) est associée à la cytotoxicité mais pas à l'échappement phagosomal et (iii) l'échappement phagosomal, prérequis à la cytotoxicité, semble nécessiter l'expression de bêtatoxine alors que cette toxine est inactivée par l'insertion d'un phage dans le gène hlb chez la majorité des S. Aureus rencontrés en clinique. Dans le but de résoudre ces contradictions apparentes, nous avons investigué de façon intégrée les impacts respectifs de l'alpha-toxine et des PSM sur l'échappement phagosomal et l'induction de l'autophagie dans un modèle ex vivo d'infection intracellulaire sur ostéoblastes humains; nous avons également testé l'hypothèse d'une excision du phage convertissant hlb (avec restauration concomitante de l'expression de bêta-toxine) induite par le stress oxydatif intraphagosomal. Des cellules MG-63 (ostéosarcome) ont été infectées par la souche SF8300 (S. Aureus hypervirulent) et ses mutants isogéniques délétés pour l'alpha-toxine (dhla), les PSMa (D.psma) ou le système régulateur agr (D.agr) contrôlant l'expression d'hla et psma. Après 6h d'infection, les cellules ont été observées en microscopie électronique à transmission (MET) pour quantifier les S. aureus libres (échappement phagosomal) ou inclus dans un phagosome ou un autophagosome. Une méthode de microscopie confocale permettant d'évaluer le taux de perméabilisation phagosomale chez une lignée MG-63 exprimant un marqueur d'intégrité phagosomale a également été développée. Enfin, les fréquences d'excision du phage convertissant hlb ont été mesurées par méthode phénotypique (modification de l'hémolyse sur gélose au sang de mouton) et génotypique (confirmation par PCR de la restauration d' hlb) en l'absence de stress, en présence de stress oxydatif in vitro (H20 2 0,9 mM) et après infection intracellulaire ex vivo. La délétion d'agr était associée à une diminution de l'échappement phagosomal (22,9% vs. 30,9%; p<0,0001, test de Fisher) et de l'induction de l'autophagie (4,3% vs. 7,6%; p<O,OOOI). La délétion depsma était associée à une diminution de l'induction de l'autophagie (3,0% vs. 7,6%; p<0,0001) mais pas de l'échappement phagosomal. La délétion d'hia n'impactait ni l'échappement phagosomal ni l'induction de l'autophagie. L'excision du phage convertissant hlb présentait une fréquence basale faible (< 1%), augmentée modestement par le stress oxydatif mais pas par le passage intracellulaire.Ce travail permet de préciser les rôles respectifs des toxines staphylococciques majeures dans la cytotoxicité des S. aureus hypervirulents: (i) le rôle cytotoxique des PSMa. est associé à l'induction de l'autophagie plutôt qu'à l'échappement phagosomal; (ii) l'alpha-toxine ne joue aucun rôle dans ce contexte chez ces souches ; et (iii) la restauration du gène hlb par excision du phage n'est ni induite ni sélectionnée après passage intracellulaire, éliminant un rôle de la bêta-toxine. Le développement d'un outil de mesure de l'intégrité phagosomale permettra de déterminer prochainement si l'induction de l'autophagie est liée à une perméabilisation de la membrane phagosomale par les PSM. Ces résultats soulignent l'importance des PSM comme acteurs majeurs de la virulence intracellulaire de S. aureus et comme cibles thérapeutiques potentiellesLYON1-BU Santé (693882101) / SudocSudocFranceF