Vers un contrôle magnétique de la polarité cellulaire

Abstract

L'imagerie In Vivo a montré comment l'établissement et la maintenance de la polarité cellulaire dépend de mécanismes complexes au travers lesquels des voies de signalisation sont régulées à l'échelle sub-cellulaire. L'intégration de ces réseaux dans l'espace intracellulaire d'une cellule polarisé n'est pas bien connue. Nous avons développé une approche permettant de sonder et perturber localement des voies de signalisation au sein de cellules vivantes : des nanoparticules magnétiques (NPMs), fonctionnalisées avec des protéines d'intérêt, sont insérées dans le cytoplasme de cellules adhérentes où elles se comportent comme des plateformes solides de signalisation. En exerçant des forces magnétiques, les NPMs sont transportées dans le cytosol pour localiser leur activité de signalisation. Nous montrons que des NPMs de différentes tailles, de 50 nm à 500 nm, peuvent être utilisées pour créer différentes distributions de protéines actives. Alors que les plus grosses particules nécessitent des forces importantes pour être transportées (> 10pN), elles permettent de créer des perturbations ponctuelles précises à la périphérie cellulaire. A l'opposé, de plus petites NPMs diffusent vite dans le cytosol (~1 m /s) et sont utilisées pour créer des gradients d'activité à l'extension comparable à la taille de la cellule. Nous avons appliqué notre approche aux voies de signalisation associées aux Rho-GTPases. En fonctionnalisant les NPMs avec des GEFs ou des GTPases actives nous avons démontré que la voie de signalisation qui lie Rac1 à la polymérisation d'actine est spatialement contrainte dans les parties protrusives des cellules. La création de gradients de GTPases est enfin discutéeIn vivo imaging has shown how the establishment and maintenance of cell polarity relies on complex mechanisms by which signaling cascades become regulated at sub-cellular levels. How signaling networks are spatio-temporally coordinated into a polarized cell is not elucidated. In this context, we developed a new tool to locally probe and perturb signaling pathways inside living cells. In our approach, magnetic nanoparticles (MNPs) functionalized with active proteins are inserted in the cytosol of mammalian cells where they behave as solid signaling platforms. By exerting magnetic forces, MNPs are manipulated in the cytosol to position their signaling activity at different subcellular locations. We show that MNPs of different sizes, from 50nm to 500nm in diameter, can be used to generate different spatial perturbation patterns. While the biggest MNPs are trapped in internal structures of the cell and require large forces (>10 pN) to be displaced, they allow us to create precise point-like perturbations at the cell periphery. At the opposite, smallest MNPs diffuse fast in the cytosol (~1 m /s) and are used to create gradient of signaling activity spanning over the whole cell. We apply our approach to the Rho-GTPase signaling network which orchestrate cell polarity and migration. MNPs were functionnalized with GEF or active GTPase. We demonstrated that the pathway linking Rac1 to actin polymerization is spatially restricted to the protrusive areas of the cell by transporting TIAM1 particles at different subcellular locations while monitoring GTPase activation and actin polymerization. The creation of intracellular GTPase gradient on cell polarity is finally discussedPARIS-BIUSJ-Biologie recherche (751052107) / SudocSudocFranceF