Développements méthodologiques en RMN 2D ultrarapide pour l étude de métabolismes

Abstract

Ultrafast (uf) 2D NMR is a very promising methodology enabling the acquisition of 2D NMR spectra in a single scan. The main goal of this work is to develop quantitative methods based on uf 2D NMR and to apply them to the quantification of metabolites in biological mixtures. Based on ultrafast 2D NMR, we developed a quantitative Multi-Scan-Single-Shot (M3S) strategy, capable of measuring absolute metabolite concentrations in complex mixtures with a high precision in a reasonable time. The analytical performance of this methodology appears much higher than the one of its conventional counterpart. In particular, uf experiments are more immune to hardware temporal instabilities, thus leading to a higher precision. A first application to the determination of metabolite concentrations in breast cancer cell extracts is presented. Another part of this thesis considers the application of such methods to the determination of 13C site-specific enrichments in biological samples, an approach which is particularly useful in fluxomics. We have designed an ensemble of methods like uf hetero-nuclear J-resolved and 3D ufJCOSY for measuring specific 13C-enrichments in a very fast and accurate way, by using experiments based on ultrafast 2D NMR. Finally, the success of an analytical method stands in its capacity to be applied by other researchers and users. Therefore, to make this methodology implementable and applicable by non-specialists, we developed a simple routine capable of translating the conventional NMR acquisition parameters (spectral widths, transmitter frequencies) into specific uf parameters (gradients and chirp pulse parameters).La RMN 2D ultrarapide (uf) est une méthodologie prometteuse permettant l obtention de spectres RMN 2D en un seul scan. L objectif principal de ce travail est de développer des méthodes quantitatives basées sur la RMN 2D uf, et de les appliquer à la quantification de métabolites dans des échantillons biologiques. Ainsi, en nous basant sur la RMN 2D uf, nous avons développé une stratégie multi-scan permettant de déterminer les concentrations absolues de métabolites dans des mélanges complexes, avec une précision élevée en un temps raisonnable. Les performances analytiques de cette approche sont nettement supérieures à celles de la RMN 2D conventionnelle. En particulier, les expériences ultrarapides sont mieux immunisées contre les instabilités temporelles de l appareillage, d où une meilleure précision. Une première application à la détermination des concentrations de métabolites dans des extraits cellulaires de cancer du sein est présentée. Une autre partie de ce travail consiste à développer et appliquer des méthodes uf pour la détermination d enrichissements isotopiques 13C site-spécifiques, dans le domaine de la fluxomique. Nous avons mis au point plusieurs méthodes ultrarapides (RMN J-résolue hétéronucléaire, ufJCOSY 3D) pour la mesure rapide, précise et juste de ces enrichissements. Enfin, le succès d une méthode analytique dépend fortement de son exportabilité. Afin de faciliter son implémentation par d autres utilisateurs, nous avons développé une interface permettant de convertir les paramètres d acquisition RMN conventionnels (largeurs spectrales, fréquences RF) en paramètres spécifiques aux expériences ultrarapides (gradients et impulsions à fréquence variable).NANTES-BU Sciences (441092104) / SudocSudocFranceF