Descripción del curso
El objetivo general de esta asignatura es capacitar a futuros profesionales e investigadores relacionados con el campo de Ciencias de la Salud con las herramientas y habilidades necesarias y suficientes para poner en práctica técnicas proteo-inmunológicas que sean resolutivas en el estudio de parásitos en un laboratorio.

Objetivos específicos
- Conocer algunas de las herramientas necesarias para el estudio proteico e inmunológico de parásitos causantes de enfermedades tropicales.
- Adquirir las habilidades necesarias por parte del alumno para el manejo de dichas técnicas en investigación básica y/o aplicada, búsqueda y mejoras de técnicas para el diagnóstico, etc

González Miguel, Javier

Hernández Mellado, Isabel

Morchón García, Rodrigo

Spanish

Gestion del Repositorio Documental de la Universidad de Salamanca

Departamento de Biología Animal, Parasitología, Ecología, Edafología y Química Agrícola.Área de ParasitologíaMÁSTER EN ENFERMEDADES TROPICALESProteómica en Enfermedades TropicalesCódigo 302731 (3 créditos ECTS)Capacitar a futuros profesionales e investigadoresrelacionados con el campo de Ciencias de la Salud con lasherramientas y habilidades necesarias y suficientes para poneren práctica técnicas proteo-inmunológicas que sean resolutivasen el estudio de parásitos en un laboratorio.ObjetivosObjetivos específicos- Conocer algunas de las herramientas necesarias para elestudio proteico e inmunológico de parásitos causantes deenfermedades tropicales.- Adquirir las habilidades necesarias por parte del alumnopara el manejo de dichas técnicas en investigación básica y/oaplicada, búsqueda y mejoras de técnicas para el diagnóstico,etc.InmunologíaCiencia que estudia todos los mecanismos fisiológicos dedefensa de la integridad biológica del organismo. Dichosmecanismos consisten esencialmente en la identificación de loextraño y su destrucción. La inmunología también estudia losfactores inespecíficos que coadyuvan a los anteriores en susDefinicionesefectos finales.ProteómicaEs el estudio y caracterización de todo el conjunto deproteínas expresadas de un genoma (proteoma). Las técnicas deproteómica abordan el estudio de este conjunto de proteínas.Actualmente, las técnicas inmunológicas y de proteómica quese emplean en el laboratorio para el estudio de enfermedadesparasitarias son de vital importancia.La mayoría de ellas se emplean para estudiar las relacionesentre el parásito y el hospedador como, por ejemplo, losParasitologíamecanismos de evasión por parte del parásito, la respuestainmune e inflamatoria del hospedador, y en su caso, el estudio deposibles moléculas que pueden llegar a inhibir el desarrollo delparásito, su diagnóstico, su modulación, su control, ser moléculasdiana, etc…1. Obtención de antígenos somáticos.2. Enzime Linked ImmunoasSorbent Assay (ELISA).3. Electroforesis monodimensional SDS-PAGE.Técnicas, metodologías y búsquedas4. Western Blot.5. Electroforesis bidimensional.6. Identificación y búsqueda de proteínas en bases de datos.1. OBTENCIÓN DE ANTÍGENOS• Los vermes adultos de D. immitis se maceran en un mortero enPBS estéril y se añaden inhibidores de proteasas.• El macerado se sonica con 3 ciclos de 70 Khz durante30 segundos a intervalos de 1 minuto, en hielo.• Centrifugar a 10.000 xg durante 30 minutos a 4°C.• El sobrenadante se almacena en eppendorfs estérilesa -80°C.• Se mide la concentración de proteínas con elkit comercial BCA (Pierce).2. ELISATipos de ELISA- La técnica de ELISA se emplea de forma rutinaria enParasitología. Con ella se pueden llegar a detectar Acsgenerados por los hospedadores (ELISA INDIRECTO) y Agsproducidos por los parásitos (ELISA DIRECTO) en sangre, suero,orina y plasma.- Se emplean Acs marcados normalmente con peroxidasas paradetectar o, en su caso, visualizar la reacción Ag-Ac.2.1. ELISA INDIRECTO2.1. ELISA INDIRECTOPRUEBADiagnóstico en gatos de la dirofilariosis cardiopulmonar felina. Tapizado 0,8 µgLavado Sol. lavadora/200 µlPostapizado BSA 5%/200 µlLavado Sol. lavadora/200 µlSueros 1:100/100 µlLavado Sol. lavadora/200 µlIg-Perox. IgGT 1:16000Lavado Sol. lavadora/200 µlSustrato Tampón OPD/100 µlDetención H2SO4 3N/100 µl-La coloración de la reacción Ag-Ac se mide en un lector deELISA (Bio-Rad) en unidades de D.O.2.1. ELISA INDIRECTO- Las muestras cuya D.O. es superior a 0,7 son positivos y losque no negativos.- El punto de corte (cut-off) para discriminar entre muestraspositivas y negativas se calcula como la media (D.O.) de lasmuestras negativas de una zona no endémica ± 3 su desviaciónestándar.2.1. ELISA INDIRECTO2.2. ELISA DIRECTOMUESTRA POSITIVAAc                              Ac-Ag                    Ac marcado                 Sustrato(Muestra)                 con enzima                     color2.2. ELISA DIRECTOPRUEBA: Diagnóstico en perros de la dirofilariosis cardiopulmonar canina.- Muestras de sangre de perros con anticuagulantes. - Kit comercial Canine Heartworm Antigen Test Kit, Petchek® HTWM PF, de los laboratorios IDEXX Inc., MA, USA. 2.2. ELISA DIRECTO¿Cómo realizar una prueba?- En cada pocillo se incuban 100 µl de sangre durante 5 minutos a temperatura ambiente.- Se retira el fluido y se añaden 2 gotas del conjugado HRPO Anti-Heartworm.- Una vez retirado el fluido, los pocillos se lavan 5 veces con una solución de tampón lavador.- Descartado el tampón lavador y secos los pocillos, se añade 1 gota de TMB (solución sustrato) a cada uno de ellos. Se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente.- Finalmente se añade 1 gota de solución STOP por pocillo y trasincubar 15 minutos a temperatura ambiente, se leen visualmentelos resultados, comparándolos con los controles.- El control negativo debe permanecer sin coloración, mientras queel positivo se tiñe de un fuerte color azul. La aparición de2.2. ELISA DIRECTOcoloración (superior a la del control negativo) en los pocillosproblema, se considera como resultado positivo.3. ELECTROFORESIS MONODIMENSIONALPRUEBA: Separar proteínas de D. immitis por su peso molecular en gelesde poliacrilamida al 12%, 1 mm de grosor.Equipo Mini-PROTEAN de Bio-Rad.3. ELECTROFORESIS MONODIMENSIONALPRUEBA: Separar proteínas de D. immitis por su peso molecular en gelesde poliacrilamida al 12%, 1 mm de grosor.Preparación de geles- Preparar el Running Gel.1. Preparar el gel de electroforesis al porcentaje del 12%. Mezclar agua +acrilamida 30% + bisacrilamida 0,8% + Tris 1,5M pH 8,8 + APS 10% + TEMED(agentes polimerizantes).3. ELECTROFORESIS MONODIMENSIONAL2. Se añaden entre los cristales y se echa isobutanol con una pipeta para evitar elcontacto de la solución con el oxígeno ya que éste impide la polimerización.Polimeriza en ±30 minutos.3. Quitar el isobutanol volcando ligeramente el montaje.Preparación de geles- Preparar el Stacking Gel.1. Poner el peine entre los cristales y añadir el gel de carga con una punta depipeta teniendo mucho cuidado con que no queden burbujas.3. ELECTROFORESIS MONODIMENSIONALMontaje de la cubeta1. Poner los geles de acrilamida en la cubeta de electroforesis (Mini Protean III),añadir el tampón de electroforesis 1X y quitar los peines.Funcionamiento3. ELECTROFORESIS MONODIMENSIONAL1. Cargar en los pocillos y añadir el volumen de muestra adecuado incluyendo unmarcador de peso molecular dependiendo del peso molecular de la proteína.2. Poner la tapa con los cables de forma que coincidan los colores y conectarlos auna fuente de alimentación. El tiempo que dura la electroforesis depende delpeso molecular de la proteína, el porcentaje del gel y el voltaje (80-120V porgel).3. La electroforesis se para cuando el frente del gel llega hasta el borde del gel.3. ELECTROFORESIS MONODIMENSIONAL4. Se puede teñir el gel con nitrato de plata3. ELECTROFORESIS MONODIMENSIONALA B2924y/o Colorante de Commassie.4. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL El objetivo es separar las proteínas mediante un gel con gradiente de pH encondiciones desnaturalizantes de acuerdo con su punto isoeléctrico(isoelectroenfoque) y por su peso molecular en gel de poliacrilamida al 12% con SDS(SDS-PAGE). El punto isoeléctrico (pI) de un proteína es su pH cuando su carga neta es 0 nodesplazándose cuando se le aplica un campo eléctrico. En un gel con un gradiente de pH, tanto los extremos N y C terminal como las cadenaslaterales ionizables de las proteínas captan o liberan protones de acuerdo con el pH, demodo que la carga eléctrica global de las proteínas dependerá del pH del entorno. Cuando se aplica un campo eléctrico, todas las moléculas con carga neta positivaserán atraídas hacia el cátodo, y todas las moléculas con carga neta negativa hacia elánodo. A medida que las moléculas de proteína se van acercando a su punto isoeléctricoirán perdiendo carga eléctrica o ganando cargas de signo contrario, hasta llegar al valorde pH en que la carga neta sea cero y las proteínas dejen de moverse y se focalizan.4. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL¿Qué significa focalizar un proteínas?- Se dice que las proteínas están focalizadas, cuando una proteína, isoformas… se hanconcentrado en un solo punto del gradiente de pH, que corresponde a su pI.- Los isoelectroenfoques se llevan a cabo a muy altos voltajes, de hasta 8000V en su faseterminal, y en condiciones fuertemente desnaturalizantes (8M urea) con tal de obtenerla máxima resolución y los resultados más limpios y reproducibles.4. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL1. El homogenado de antígeno se ultracentrifuga a 100.000 xg durante 1 hora a4°C, se dializa durante 24 horas frente a agua milli-Q. Este antígeno sedenomina “fracción sobrenadante”. Se divide en alícuotas y se almacena a -80°C hasta su utilización.PRUEBA: Separar proteínas de D. immitis por su peso molecular ymediante un gradiente de pH en geles de poliacrilamida y SDS (SDS-PAGE) al 12%, 1 mm de grosor.• Solubilización del extracto antigénico1. Descongelar el extracto antigénico y poner de 1-500 µg de proteína en unvolumen final de 100 µl en un Eppendorf de 1,5 mL. Utilizar el kit comercialReadyPrep 2-D Clean Up (Bio-Rad) para precipitar las proteínas de la muestra.4. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL2. El sedimento resultante se resuspende en un tampón desolubilización/rehidratación Urea 7M - Tiourea 2M.3. Las muestras se dividen en alícuotas de 125 µl de tampón de rehidratación,conteniendo cada una de ellas 40 µg aproximadamente de proteína.4. Finalmente se almacenan a -20°C hasta su utilización. Cuando se van a utilizar,se añade a la alícuota de 125 µl de muestra DTT 5M y anfolitos del intervalode pH 3-10 en proporción 1:100. Se incuban durante 15 minutos atemperatura ambiente y con agitación suave.5. El producto de la incubación se centrifuga durante 15 minutos a 16.000 xg a4°C.4. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL• Rehidratación de las muestras en tiras IPG1. Una vez solubilizadas, las proteínas (125 µl) seaplican en tiras IPG de 7 cm de longitud (Bio-Rad) de intervalos de pH 3-10. En primer lugar,repartimos los 125 µl de muestra en uno de loscarriles de la bandeja de rehidratación.2. A continuación, se retira la tira protectora deplástico de la tira y la ponemos con el gel bocaabajo sobre la muestra.4. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL3. Se esperan unos 10 minutos, se cubren las tiras con 2 mL de aceite mineral yse introduce la bandeja en el aparato de IEF. Este se programa para que realiceuno de los métodos de rehidratación (pasiva o activa):- Rehidratación pasiva: método en el cual no se aplica un campo eléctricodurante el proceso. Se lleva a cabo en bandejas de rehidratación (Bio-Rad). Elproceso se realiza durante 14-16 horas a 20°C en el equipo deisoelectroenfoque (IEF) Protean IEF Cell (Bio-Rad).- Rehidratación activa: método en el cual se aplica un pequeño voltajeconstante de 50 v durante el proceso. Se procede del mismo modo que en larehidratación pasiva, pero se utiliza una bandeja de IEF (Bio-Rad).4. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL• Isoelectroenfoque (IEF)1. Se colocan la tiras IPG en bandejas de IEF para tiras de 7 cm dentro del equipoProtean IEF Cell con una temperatura constante de superficie de 20°C y unamperaje máximo de 50 µA por tira IPG. Cubrir con unos 2 mL de aceitemineral, tapar la bandeja IEF y programar el aparato IEF para el intervalo depH 3-10.Tiempo Voltaje RampaStep 1 (S1) 15 minutos 250 v RápidaStep 2 (S2) 2 horas 4.000 v RápidaStep 3 (S3) 16.000 v/hora 4.000 v RápidaStep 4 (S4) 99 horas 500 v Rápida4. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL• Equilibrado de las tiras IPG1. Sacar la tira de la bandeja IEF y colocarla en una bandeja de rehidratación.2. Incubar la tira IPG con 2,5 ml de tampón de equilibrado más 0,05 g deditiotreitol (DTT) durante 15 minutos en agitación suave.3. Incubar la tira IPG con 2,5 ml de tampón de equilibrado más 0,0625 g deiodoacetamida durante 10 minutos en agitación suave.4. ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL• Electroforesis de las tiras IPG o 2ª separación•Tinción de plata y/o Colorante de Coomassie.Tras la tinción del gel las proteínas aparecen formando manchas circulares (spots). PDQuest (Bio-Rad Laboratories) 5. WESTERN BLOTTransferencia semiseca1. Preparar 100-200 ml de tampón de transferencia 1X 20% de metanol y ponerlo a 4ºC.2. Una vez finalizada la electroforesis, se corta la membrana NITROCELULOSA y se hace unapequeña muesca en una esquina para saber el orden de las muestras. Protegerlas de laluz.3. Preparación del Sandwich: Se humedece con el tampón papel grueso y el gel de electroforesis. Poner en orden:- Un papel grueso humedecido en tampón de transferencia.- La membrana de NITROCELULOSA con pinzas.- El gel de acrilamida sin burbujas entre el gel y la membrana.- Poner otro papel grueso humedecido en tampón de transferencia.4. Cerrar el aparato de electrotransferencia semiseca y conectar los electrodos a unafuente de alimentación.5. Parámetros de la fuente de alimentación: 20 V (constantes), 30 min.6. Una vez terminada la transferencia sacar la membrana y hacer un lavado rápido contampón de lavado.5. WESTERN BLOT7. Se puede comprobar que todo ha salido bien tiñendo el gel con AgNO3 y con Colorantede Coomassie.Bloqueo1. Bloquear las membranas durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se  colocan en bandejas con 15 ml de volumen total de tampón de bloqueo. Es posible guardarlas a -20ºC en papel albal.Incubaciones con AcD.1. Anticuerpo primario1. Finalizado el bloqueo se añade el suero de la muestra problema. El anticuerpoprimario se diluye en el mismo tampón de bloqueo directamente. Mantener elsuero en agitación durante 1:30 h a temperatura ambiente tapado con papelalbal.5. WESTERN BLOT2. Retirar la dilución del anticuerpo y hacer 3 lavados de 5 minutos con tampón delavado dependiendo de la membrana empleada en agitación.D.2. Anticuerpo Secundario1. El anticuerpo secundario, al igual que el primario, puede ir disuelto en tampón debloqueo. Dejarlo 1 hora en agitación a temperatura ambiente.2. Retirar la dilución del anticuerpo y hacer 3 lavados de 5 minutos con tampón de lavado.Revelado1. Añadir el SUSTRATO CON PEROXIDASA al momento:2. A los 10-20 minutos se para la reacción con AGUA DESTILADA, se coloca la membranaen papel de filtro para que se seque y se escanea.5. WESTERN BLOTPDQuest (Bio-Rad Laboratories) 7. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAShttp://www.uniprot.org/7. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS7. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS7. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAShttp://www.geneontology.org/7. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAShttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS7. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS7. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

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