Se evaluó la posibilidad de predecir una probable estructura secundaria para el Receptor Opioide Kappa 2 humano tomando como base la secuencia de aminoácidos del Receptor Opioide Kappa 1 humano. La estructura predicha mostró ser compatible con los datos que se poseen acerca de este tipo de receptores. Con esta prueba inicial, el proyecto que tiene como objetivo principal diseñar un análogo proteico para el Receptor Opioide Kappa 2 humano, ha mostrado el nivel mínimo de viabilidad necesario para ser continuado

Beltrán Velasquez, Sonia Viviana

Fajardo G., Diego

Hernandez Morales, Adriana

Jiménez, Monica Bibiana

Mantilla, Bernardo

Moya G., Paola

Palacios Morillo, Eliana Patricia

Paris B., Carolina

Rodriguez Zuluaga, Javier

Rojas, Juan Diego

Sanchez Ojeda, Federico

Suarez Franco, Christian

Velásquez Álvarez, Alvaro Andrés

Acta Biológica Colombiana

Spanish

Sonia Viviana Beltrán Velasquez

Diego Fajardo G.

Adriana Hernandez Morales

Monica Bibiana Jiménez

Bernardo Mantilla

Paola Moya G.

Eliana Patricia Palacios Morillo

Carolina Paris B.

Javier Rodriguez Zuluaga

Juan Diego Rojas

Federico Sanchez Ojeda

Christian Suarez Franco

Alvaro Andrés Velásquez Álvarez

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Avance en el diseño de un péptido bloqueador del receptor Opioide Kappa 2 humano

Universidad Nacional De Colombia - Repositorio Institucional UN

Acta Biol6gicaColombiana, Vol. 5 No.2, 2000 9AVANCE EN EL DISENO DE UN PEPTIDO BLOQUEADORDEL RECEPTOR OPIOIDE KAPPA 2 HUMANOSONIA VIVIANA BELTRAN V., DIEGO FAJARDO G.,ADRIANA HERNANDEZ M., MONICA B.jIMENEZ,BERNARDO MANTILLA, PAOLA MOYA G.,ELiANA P. PALACIOS M., CAROLINA PARIS B.,JAVIER RODRIGUEZ Z., JUAN DIEGO ROJAS,FEDERICO SANCHEZ 0., CHRISTIAN SUAREZ E,ALVARO A. VELASQUEZ A.Estudiantes, Facultad de Ciencias,Pontificia Universidad javerianaSe evaluo la posibilidad de predecir una probable estructura secundaria para el Re-ceptor Opioide Kappa 2 humano tomando como base la secuencia de aminoacidosdel Receptor Opioide Kappa 1 humano. La estructura predicha mosrro ser compati-ble con 105 datos que se poseen ace rca de este ripe de receptores. Con esta pruebainicial, el proyecto que tiene como objetivo principal disenar un analogo proteicopara el Receptor Opioide Kappa 2 humano, ha mostrado el nivel rrunimo de viabili-dad necesario para ser continuado.Palabras c1aves: Opioide, Kappa 2, Cocafne. Dopamina, Diseno de Proteinas.INTRODUCCIONLa posicion de Colombia como el mayor productor de cocafrta del mundo, hace quecorramos el riesgo de transformarnos, al igual que algunos pafses africanos, en vfc-timas de su consumo. EI oeste y el sur de Africa se han convertido no solo en puntosimport.antes para el transbordo de sustancias psicoacrivas, sino tambien en areas decreciente consumo local de cocarna y herofna. En Sud africa, por ejemplo, ha habidoun aumento del trafico y la adiccion al "crack" y la cocarna, miencras que Cabo Verdeexperimenta una adiccion en aumento como efecto secundario del trafico. Comoagravante al problema, la crisis econ6mica que atraviesan los parses africanos, centroy suramericanos estimula aun mas la producci6n y el consumo de estas sustancias.Sin embargo, esta es una situacion que comenzamos a compartir con otras regie-nes del planeta: la propagaci6n rapida de cultivos ihciros. trafico y con sumo en losparses del centro de Asia, Kasajstao, Kyrgistan, Tayikisran, Turkmenistan y Uzbekistany el Caucaso. Kasajstan tiene la unica region del mundo en donde la marihuana creceen forma silvestre (aproxirnadamente 3'000.000 de hectareas ) y podrfa convertirse enfuente irnportanre de marihuana traficada ilfcitarnente U IFE, 1999).La cocafna es una de las drogas adicrivas mas potentes. Una vez que una persona haprobado la cocafna, no puede preyer ni concrolar basta que punto seguira usandola.Las principales form as de administraci6n de cocalna son la aspiraci6n 0 inhalacion,la inyecci6n y el fumar (incluso cristales de cocatna y crack). Varios estudios indican10 Nota Breve - Avances en el diseno de un peptido bloqueador del receptor Opioide Kappa 2 humano, Beltran et ai.que al parecer, el uso compulsive de cocama puede verse acelerado si [a sustanciase fuma en lugar de absorberse por via intranasal. EI fumar permite que dosis extre-madarnente altas de cocafna Ileguen al cerebro muy rapido y produzcan un estfmulointense e inmediato (NIDA, 2000b).La Dopamina fluye desde la neurona presinaptica a la sinapsis para formar un nexotemporal can un receptor en la membrana postsinaprica y asf transmitir una serial entrelas dos neuronas; normalmente la Dopamina se evacua de la sinapsis al ser recaptadapor la neurona presinaptica, como resultada de la acci6n de "transporrador" cuyasmolecules se lacalizan sobre la superficie de la neurona presinaprica. Los efectos de lacocalna se originan en su acci6n sabre la permanencia de la Dopamina en las sinapsis.La Dopamina es un neurotransmisor, una sustancia qufmica que lleva mensajes desdeuna neurona a otra 0 desde una regi6n funcional del cerebro a otra. Este neurotrans-miser se encuentra asociado con el movimiento del cuerpo, la conciencia, el raciocinio,la capacidad de emitir juicios, la rnotivacion y el placer y se libera coma parte delsistema de recompensa del cerebro y tiene que ver con el esnrnulo que caracterizael consumo de cocaina (NIDA, 2000a; Volkowetal., 1997). La cocalna se une a la Pro-tern a Transportadora de Dopamina, bloqueando de esta forma, la recaptacion del neu-rotransmisor y aumentando los niveles sinapticos de Dopamina; este incremento enla concentraci6n de Dopamina en el espacio sinaptico serfa el responsable de unaconstante estimulacion de la membrana postsinaptica, conducenre al desarrollo de laeuforia observable en las personas que consumen este alcaloide (Volkow et al., 1997).Existe una fuerte tendencia hacia la busqueda de posibles tratamientos farmacol6-gicos para el control de la dependencia generada por la cocalna y otros alcaloides.Algunas investigaciones recientes (Pilotte, 1997; Staley et al., 1997; NIDA, 2000a),han mostrado que el activar ciertos receptores cerebrales puede ser uti I para tratarel alcoholismo. Los investigadores hallaron que si se activa un receptor espedficodel cerebra, lIamado Receptor Opioide Kappa, parece que se reduce [a euforia 0sensaci6n de bienestar producida por muchos akaloides que causan adicci6n, indu-yendo el etanol, y la cocafna. Esto implica que si se disminuyen los efecros euf6ricosde las drogas tambien se puede reducir el deseo de ingerirlas.MATERIALES Y METODOSEI presente informe de avance corresponde a un proyecto que tiene como objetivogeneral diseriar un peptido bloqueador para el Receptor Opioide Kappa 2 humano,como alternativa para el tratamiento de la dependencia a la cocalna. La realizaci6nde este proyecto se ha planeado en la siguiente forma:OBTENER LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DEL RECEPTOR KApPA 2 HUMANO:Debido a la trascendencia econ6mica que conlleva la obtencion de un peptido de estanaturaleza, buena parte de la informaci6n concerniente al Receptor Kappa 2 huma-no se encuentra restringida al uso interno de los laboratorios que se hall an tras eldiseiio de este peptido, con fines comerciales. Por esto, nos hemos visto obligadosActa Biol6gica Colombiana, Vol. 5 No.2, 2000 11a enfrentar el problema, prediciendo las estructuras secundarias y rerciarias del Re-ceptor Opioide Kappa 2 humano, en la siguiente forma:Seleccionando un Receptor Kappa humane.Prediciendo su estructura secundaria a partir de su secuencia.Encontrando el sitio mas probable de union con el liganda.Prediciendo la estructura rerciaria del sitio mas probable de union con el ligando.Reconstruyendo la estructura terciaria aproximada para este sitio de union.Disefiar un peptide que bloquee este sitio de union.Probar el peptide diseriado.PREDICCl6N DE LA ESTRUcrURA SECUNDARIA DEL RECEPTOR QPIOIOE KApPA 1 HUMANO:Se obtuvo una copia de la secuencia de aminoacidos del Receptor Opioide Kappa 1humano, a partir de la base de datos lIamada Swissprot, empleando para ello el pro-grama Entrez ubicado en el Centro Nacional para la Informacion en Biotecnologta,Estados Unidos (NCBI). La secuencia fue comparada contra todas las secuenciasde a.rninoacidos de las proreinas conocidas, presentes en Swiss prot, en busca de lasmas parecidas; esta comparacion se hizo con el fin de confirmar la presuncion de quelas secuencias de aminoacidos de los Receptores Opioides son muy similares entresf; para esto se empleo el programa Blast presente en el NCBI. Se realize una pre-dicci6n por concenso de la estructura secundaria del Receptor Opioide Kappa 1humano, utilizando el programaJpred2.RESULTADOSSECUENCIA DEL RECEPTOR QPIOtDE KApPA 1 HUMANO:Se escogio esta proteina debido a que es el unico receptor opioide humano de c1aseKappa presence en el banco de secuencias. Los datos de la secuencia de aminoacidosy sus parametres derivados son los siguienres:giI4505511IrefINP_000903.1IpOPRKll receptoropioide, kappa 1MESPIQIFRGEPGPTCAPSACLPPNSSAWFPGWAEPDSNGSAGSEDAQLEPAHISPAIPVIITAVYSWFWGLVGNSLVMFVIIRYTKMKTATNIYIFNLALADALVTTTMPFQSTVYLMNSWPFG DVLCKIVISI DWN MFTSI FTLTM MSVDRYIAVCH PVKALDFRTPLKAKII N ICIWLLSSSVGISAIVLGGTKVREDVDVI ECSLQFPD DDYSWWDLFM KICVFI FAFVI PVLII IVCYTLM ILRLKSVRLLSGSREKDRNLRRITRLVLVWAVFWCWTPIHIFILVEALGSTSHSTAALSSWFCIALGYTNSSLNPILYAFLDENFKRCFRDFCFPLKMRMERQSTSRVRNTVQDPAYLRDIDGMNKPVNumero de aminoacidos: 380Peso molecular: 42659.2 dalronspi teorico: 7.92Los alineamientos realizados con Blast nos mostraron que las procefnas mas parecidasen su secuencia, al Receptor Opioide Kappa 1 humano son 105 demas receptores opioi-des, tanto en el humano como en otras especies (datos no presentados)., 2 Nota Breve - Avances en ei diseio de un piptido bloqueador del receptor Opioide Kappa 2 humane, Beltran et al.PREDICCl6N DE LA ESTRUcruRA SECUNDARIA:EI resultado final de la predieci6n es el siguiente (los numeros indican las posicionesde los aminoacidcs):30- - - - -, -, - -- - - - - - - - - - - - - - - - - - -,H,H,H,30H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H, -, - --, -, -, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, -, H, H, H, H, H, H, H, -,-, -, -, -, -, -, -, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, -, H, H, H, H, H, H, H,H, H, H, H, -, -, H, E, E, E, E, H, -, -, -, -, -, -, -, -, -, -, H, H, H, H, H, H, H, H,H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, -, -', -, -, -, -, -, -. E, E, E, E, -,-, -, -, -, -, -, -, ", H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H,H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, -, -, -, -, -, -, H, H, H, H, H, H, H, H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,H,-, - - -, -, -, -, -, -, -, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, - -, H, H, H, H, H, H, H, H,H, H, - -, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H, H,DISCUSIONLa subdivision de los reeeptores opiaceos en diferentes grupos, fue propuesta canbase en el heeho de que la nalorfina tiene un efeeto antagonista analgesico, a pesarde poseer un efeeto analgesico propio Corbett et aI., 1999 conduy6 que la analge-sia producida por la nalorfina era debida a su accion sobre unos receptoresespedfieos, identifieados luego como Reeeptores Kappa. Pese a su clasificacion,todos los Receptores Opioides donados hasta el rnornento poseen la misma es-tructura general: tienen el extremo N-terminallocalizado hacia la eara extracelular dela membrana, siete dominies transmembranales y una estructura en forma de colaque posee el extrema C·terminal y se localiza intracelularmente. Dencro de losReceptores Kappa, los subtipos Kappa 1 y Kappa 2 se distinguen farmacologica-mente debido a las diferentes especificidades de union para algunos agonistassintencos, sin embargo, no parecen presentar mayores diferencias en cuanto a launion a sus ligandos endogenos; esta afirrnacion es reforzada por hecho de quetodos los Receptores Opioides pertenecen al mismo grupo de receptores: las pro-teinas G (Corbett et ai., 1999).En un estudio reciente, fue aislado un eDNA humano complete, que codifica el Re-ceptor Opioide Kappa 1, empleando para ello, eI eDNA del Receptor Opioide Deltadel raton. La organizacion del gen del Receptor Opioide Kappa 1 encontrado en esteestudio, pareee ser similar a la del gen del Receptor Delta del raton, presentandoun limite intron-exon localizado luego de la posicion de los dominies putativos trans-membrana 1 y 4. EIgen para Kappa fue mapeado en las posiciones q 11-12 en el cro-mosoma 8 (Simonin et al., 1995). EI producto de este gen, corresponde a la secuenciaActa BiofOgicaCotomoiana, Vol. 5 No.2, 2000 13empleada en este trabajo como base para predecir su estructura secundaria. La es-tructura secundaria predicha nos muestra la posible existencia de siete helices separa-das por segmentos de aminoacidos probablemente organizados en vueltas; a pesarde 10 sugestivo de su organizaci6n, creemos que son necesarios algunos estudiosadicionales que nos permitan predecir la orientacion de estas helices y la existenciade dominios transmembranales dentro de la secuencia. Pese a esto, al comparar la se-cuencia con la predicci6n (datos no presentados), se puede ver como la mayor partede los aminoacidos alifaticos se hallan presentes en las helices.Estos hechos nos Ilevan a pensar que es posible suponer una alta homologfa entrelas secuencias de los Receptores Opioides del hombre y de otras especies entre sfy, por en de, serta esperable, el hal Jar que las prorernas mas semejantes en secuencia,a la del receptor escogido, fueran todas elias Receptores Opioides, tal y como 10muestran los resultados de los alineamientos obtenidos con Blast. De ser cierta estaapreciaci6n, sera posible acercarse a la estructura terciaria del Receptor OpioideKappa 2 a partir de la secuencia del Receptor Opioide Kappa 1.CONCLUSIONESLas semejanzas funcionales y de secuencia, existentes entre los Receptores Kappase pueden ver manifestadas como parte de la explicacion de los resultados obtenidosal comparar la secuencia del Receptor Opioide Kappa 1 con las secuencias de las de-mas protefnas conocidas.Una primera aproximacion a la busqueda de una molecule proterca que se unaal Receptor Opioide Kappa 2 humane, nos ha permitido caracterizar la posibleestructura secundaria de un receptor hornologo a el. La estructura predicha parececorresponder a la organizaci6n general de los aminoacidos que integran los Recep-tores Opioides. Es necesario realizar otros anal isis y predicciones para corroborarla afirmaci6n anterior, asf como para enriquecer los detalles estructurales del receptorinvestigado.BIBLIOGRAFiACORBETT, A., MCKNIGHT S. & HENDERSON G. 1999. Opioid Receptors,Pharmacological Reviews, Tocris Cookson Inc, USA.INSTITUTO NACIONAL SOBRE DROGADICCI6N (NIDA); 2000a. Explicacion delAbuso de Drogas y la Drogadiccion, Informe 12948, junio de 2000.INSTITUTO NACIONAL SOBRE DROGADICCI6N (NIDA); 2000b. Nuevas Con-c1usiones en Estudio de Consume de Drogas y Drogadicci6n, Comunicado deprensa, Washington, D.C., 16 de junio de 2000.JUNTA INTERNACIONAL DE FISCALIZACI6N DE ESTUPEFACIENTES; 2000.Informe correspondiente a 1999, New York, 23 de febrero de 2000.PILOTTE, N. S. Neurochemistry of cocaine withdrawal, Curr-Opin-Neurol. 1997 Dec;1O(6): 534-8.14 Nota Breve - Avances en ei disefw de un peptido bloqueador del receptor Opioide Kappa 2 humano, Beltran et at.SIMONIN, F., GAVERIAUX-RUFF, c., BEFORT, K., MATTHES, H., LANNES, B.,MICHELETTI, G., MATTEI, M. G., CHARRON, G., BLOCH, B. & KIEFFER, B.Kappa-Opioid receptor in humans: cDNA and genomic cloning, chromosomalassignment, functional expression, pharmacology, and expression pattern in thecentral nervous system. Proc Natl Acad Sci USA 1995JuI18;92(15):7006-10.STALEY, J. K.; ROTHMAN, R. B., RICE, K.C., PARTILLA, J & MASH, D. C. 1997Kappa2 opioid receptors in limbic areas of the human brain are upregulatedby cocaine in fatal overdose victirns.j-Neurosci. 1997 Nov 1; 17(21): 8225-33.VOLKOW, N. D, WANG, G. J., FISCHMAN, M. w., FOLTIN, R. w., FOWLER, J. S,ABUMRAD, N. N., VITKUN, S., LOGAN, j., GATLEY, S. j., PAPPAS, N.,HITZEMANN, R. & SHEA, C. E. Relationship between subjective effects ofcocaine and dopamine transporter occupancy. Nature 386:827-830, 1997.

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