Blaha, Georges

Horizon / Pleins textes

Les supports biochimiques 
de la sensibilité 
et de la résistance du Cacaoyer 
à Phytophthora palmivora. 
Orientation des recherches 
au Cameroun 
Disposant de nombreuses variétés de cacaoyers et 
ayant déterminé pour la plupart d’entre elles à la fois 
leur vulnérabilité épidermique et leur sensibilité in- 
terne à Phytophthora palmivora, il nous a été possible 
d’entreprendre une analyse biochimique fine axée sur 
la recherche des supports de la sensibilité et de la 
résistance. 
1. PROGRAMME DE TRAVAIL 
Ce programme est établi en fonction des travaux 
déjà réalisés ou en cours [3], [4], [6]. Tous ces travaux 
faisant état du rôle possible des polyphénols dans la 
résistance à P. palmivora, notre programme prévoit 
donc : 
1) Une détermination des polyphénols présents tant 
dans les cabosses sensibles que dans les cabosses de 
type résistant, ceci aussi bien à l’état sain qu’à l’état 
parasité ; 
2) Un complément à cette étude de base par une 
étude des précurseurs des polyphénols en particulier 
au niveau acides organiques et acides aminés. Cette 
étude complémentaire implique, non plus l’étude de 
cabosses en voie de maladie comme le nécessite surtout 
la première phase mais essentiellement une étude des 
cabosses à l’état sain. 
En définitive, nos analyses ont débuté par l’étude 
des cortex sains et ce n’est que dans un deuxième temps 
que nous prévoyons l’étude des cortex en voie de 
pourrissement. 
II. TRAVAUX EN COURS : 
ÉTUDES ANALYTIQUE~ DES CORTEX 
SAINS 
CHOIX DU MATÉRIEL CLONAL 
En fonction de leur réaction propre à la maladie, 
les clones retenus ont été les suivants : 
- résistants : SNK 32, ICS 84 et SNK 64 
- moyennement sensible : SNL 37 
- très sensibles : ICS 40, SNK 10 et SNK 344 
Les cabosses sont de taille adulte mais encore 
immatures. 
G. BLAHA 
Phytopathologiste IFCC-Cameroun 
MODALITÉ DES PRÉLÈVEMENTS 
Afin de tenir compte d’observations faites lors des 
tests de sensibilité [7] ou lors du processus de péné- 
tration du champignon [8], les prélèvements inté- 
ressent trois zones distinctes du cortex et selon des 
quantités de matière fraîche toujours les mêmes quel- 
que soit l’étude envisagée, polyphénols ou précur- 
seurs : 
Epiderme : 
Sous-épiderme (ou épicarpe) : 
5g 
Mésoderme (ou endocarpe) : 
10 g 
10 g 
Les prélèvements d’épiderme se font soit à l’épluche 
légumes (cortex lisse) soit par grattage à l’aide d’une 
lame de rasoir (cortex verruqueux). Un prélèvement 
supplémentaire est chaque fois effectué pour permettre 
d’évaluer par poids secs, la teneur en eau des tissus 
au moment de leur prélèvement. 
MÉTHODESUTILISÉESPOURL'ÉTUDEDEYPOLYPHÉNOLS 
a. Fixation et extraction 
La fixation et les extractions successives sont 
menées à froid dans des bains eau-glace et sous agita- 
tion magnétique. On a utilisé soit du tnéthanol pur (mé- 
thode classique) soit de l’éthanol. Avec ce dernier 
solvant, les fixations ont lieu dans l’éthanol à 950 G.L. 
et les épuisements successifs dans l’éthanol à 900 
(2 fois) et à 800 G.L. (3 fois). 
Que les opérations se fassent avec le méthanol ou 
avec l’éthanol, on filtre chaque fois et on réunit les 
alcoolatures d’un même échantillon que l’on stocke 
au congélateur à - 100 C (durée des opérations : 
8 heures). 
b. Fractionnement de l’extrait h.ydroalcoolique 
Les alcoolatures sont concentrées sous vidr: à l’éva- 
porateur rotatif et à une température ne dépassant 
pas 320 C. On procède ensuite sur l’extrait hydro- 
alcoolique à une délipidation par l’éther de pétrole 
puis on ajuste l’extrait à un volume connu (100 ml). 
On le fractionne alors en 4 lots de volume semblable 
(25 ml). Chaque lot est destiné à une étude bien pré- 
cise : 
- le lot no 1 constitue l’extrait brut et est surtout 
destiné à un dosage des polyphénols totaux ; 
Cah. ORSTOM, sér. Bd., no 20, 1973 : 15-17 15 
G. Blaha 
- le lot no 2 est purifie par extractions successives 
par des solvants non miscibles ; 
- le lot no 3 subit une hydrolyse acide et est en- 
suite purifié comme le lot no 2 ; 
- le lot no 4 subit une hydrolyse alcaline et est 
ensuite purifié comme les lots no 2 et 3. 
c. Opérations de puri$cation 
J xs lots 2, 3 et 4 permettent une identification de 
polyphénols et de leurs aglycones. Les opérations de 
purification que l’on entreprend sur chacun d’eux et 
qui, rappelons-le, sont semblables, sont les suivantse : 
- lrc purification à l’éther éthylique 
- 2e purification à l’alcool isoamylique 
- 3e purification à l’acétate d’éthyle 
Chaque phase qui en résulte : phase éthérée, phase 
isoamylique, phase acétate et phase aqueuse restante 
fait ensuite l’objet de chromatographies sur papier 
Whatman no 1 dans différents systèmes solvants : 
- Butanolacétique 
(butanol+acide acétiqueSeau dans les pro- 
portions 4.1.5.) 
- Forestal 
_ T~la$~~ ackique, eau, HC1 3.1.3.) 
(toluène, acide acétique, eau 4.1.5.) 
- Acétate d’éthyle 
(acétate d’éthyle, acide formique, eau 10.2.3). 
- Acide acétique 
(10% dans l’eau) 
MÉTHODES D’ÉTUDE DES ACIDES ORGANIQUES ET DES 
ACIDES AMINÉS 
a. Fixation et extraction 
La fixation et les extractions se font à froid dans 
des bains eau-glace et sous agitation magnétique. On 
utilise d’abord l’éthanol à 950 G.L. pour la fixation 
puis l’éthanol à 600 G,L. pour les épuisements succes- 
sifs. 
Les alcoolatures d’un même échantillon sont réunies, 
concentrées sous vide, puis amenées à un volume 
connu. 
b. Opérations de purification 
Après délipidation de l’extrait par l’éther de pétrole 
on procède aux opérations de purification en utilisant 
des résines échangeuses d’ions telles la Dowex 50 
fortement cationique et les Dowex 1 et 2 anioniques 
selon le schéma suivant : 
Extrait hydroalcoolique 
1 
Dowex 50 
Elution 
- Acides aminés -+ Chromatographie sur 
1 
papier 
Effluent 
1 Elution 
Dowex 2 - Acides organiques-+ Chromatographie de 
-1 
partage par élu- 
tions fractionnées 
Effluent sui Dxl 
(substances neutres) 
III. ÉTAT ~T~EL DES RECHERCHES 
Nous devons signaler qu’avec la phase isoamylique 
des lots no 2 des 7 clones à l’étude, il apparaît et 
ceci seulement avec les extraits épidermiques éthano- 
liques, une substance dont la concentration semble 
reliée à la sensibilité du clone expérimenté : très peu 
visible après révélation avec les clones résistants 
SNK 32, ICS 84 et SNK 64, cette substance est heau- 
coup plus visible avec SNK 37 moyennement sensible, 
très visible ensuite avec ICS 40 et SNK 10. Elle atteint 
une coloration maximum avec SNK 344 (cf. figure). 
Les solvants qui permettent sa séparation sont le 
butanol acétique et l’acétate d’éthyle. 
Le rf moyen dans le butanol acétique est de 79,6 
et dans l’acétate de 83,6. 
Le révélateur utilisé a été le mélange vanilline- 
acide chlorhydrique et la coloration obtenue, jaune 
beige à brun. 
En vue d’identifier cette substance, une trentaine 
de révélateurs ont été utilisés, 10 ont donné des 
réactions positives, dont : 
- la vanilline à 1% dans l’éthanol à parties égales 
avec l’acide perchlorique aqueux à 30/, -f coloration 
bleue 
- la vanilline à 170 dans PO,H, aqueux à 50°/u -+ 
brun rouge 
- le réactif de Dragendorff + marron 
- le réactif de Mayer -f jaune 
- le réactif de Aciff --f blanc sur fond rose violacé 
- le nitrate d’argent ammoniacal -+ blanc sur 
fond brun 
En fonction des révélateurs utilisés et de leurs spé- 
cificité, les seuls renseignements que l’on ait se ré- 
sument : 
1) à la présence de liaisons insaturées types céto- 
niques ; 
2) à la présence d’un groupement azoté. 
Bien que, pour des raisons pratiques, nous ayons 
modifié quelque peu l’etude classique des polyphénols 
(en remplaçant notamment le méthanol par l’éthanol 
et en introduisant l’alcool isoamylique dans nos puri- 
fications [SI, la phase isoamylique chromatographiée 
devait donner principalement des composés phéno- 
l’ iques du type anthocyanes et lcucoanthocyanes peu 
polymérisés ressortant en rouge ou rose vif avec la 
vanilline chlorhydrique. La coloration différente brige 
à brune obtenue avec la substance en question nous 
fait exclure son appartenance à de tels phénols. 
Les révélations positives obtenues par la suite en 
chromatographiant un des 7 clones seulement (ICS 40) 
as& bien fourni en cette substance nous a donné des 
couleurs spécifiques aux polyols, aux stérols, aux 
alcaloïdes, aux stéroïdes alcaloïdes et aux purines. Ce 
chevauchement outre des fonctions communes comme 
les groupements azotés laisserait supposer cependant 
un mélange de substances plutôt que la présence d’une 
substance pure. Ce qui est finalement presque certain 
les chromatographies ayant été réalisées dans une 
seule dimension. L’élution des bandes de rf 83,6 de 
préparatives dans l’acétate d’éthyle et le tracé du 
spectre d’absorption aux U.V. de ces élutions ont fait 
16 Cah. ORSTOM, sér. Bd., no 20, 1973 : 15-17 
Les supports biochimiques de la sensibilité et de la résistance du cacaoyer à P. polmirora 
apparaître un pic important d’absorption à 220 rnp 
rappelant le A maximum de l’acide 3 indol acétique 
mais les D.O. pour SNK 32, SNK 64, SNK 10 et 
SNK 344 font ressortir un classement différent de 
celui obtenu avec la vanilline chlorhydrique démon- 
trant la non pureté des élutions des bandes de rf 83,6. 
SNK32 ICS84 SNKo4 SNK37 ICSIO SNKIO SNK344 
sensibilité croissante 
? 
.(‘$: Q 0 .A.’ brun 
beige sale vert 
Rev. Vanilline - HCI 
? 
front du solvant 
En définitive, les dosages et les identifications tant 
pour les phénols que pour les précurseurs du type 
acides organiques et acides aminés se poursuivent 
mais le Laboratoire de Phytopathologie de I’IFCC- 
Cameroun met l’accent sur les recherches concernant 
la substance mise en évidence. Des essais comparatifs 
entre clones de sensibiités distinctes sont en cours et 
des prélèvements importants d’épiderme ont été 
réalisés et sont en voie de purification afin de pouvoir 
disposer de quantité importante de matière. 
Jusqu’à présent, en effet, les hypothèses concernant 
les supports biochimiques de la résistance reposaient 
sur l’existence de substances de nature phénolique 
inhibitrices donc présentes uniquement chez les ré- 
sistants et induites semble-t-il au moment de la pené- 
tration et de la toute première extension du parasite 
à l’intérieur de l’hôte [3]. La substance mise en évi- 
dence dans nos chromatographies vepose le problème : 
PI 
PI 
131 
M 
FI 
[61 
c71 
PI 
la sensibilité est-elle conférée dans la cabosse encore 
saine par une substance sensibilisante en quantité de 
plus en plus forte chez les clones de plus en plus sen- 
sibles à la pourriture brune ? S’agit-il d’une substance 
stimulante ou nécessaire au champignon pour sa 
croissance ? d’une substance favorisant les systèmes 
enzymatiques du champignon ? ou au contraire d’un 
précurseur de polyphénols élaborés en réponse à l’in- 
fection devenant toxiques pour la plante elle-même ? 
ROCHA et JIMMENEZ au Brésil [78] ont bien montré 
par des dosages quantitatifs que ICS 40 sensible, une 
fois nécrosé avait beaucoup plus de phénols que les 
cabosses saines et SCA 6 résistant ne présentait lui, 
aucune différence entre saine et parasitée. 
Quoi qu’il en soit la mise en évidence d’une telle 
substance dans 7 clones distincts en relation semble-t-il 
avec leur degri: de sensibilité mérite une attention 
toute particulière : cette substance pourrait, en effet, 
servir de marqueur dans la recherche des cultivars 
résistants à la pourriture brune au Cameroun. 
BIBLIOGRAPHIE 
BLAHA (G.) - 1971 = Etat d’avancement de la 
recherche de cacaoyers rkistant s au Cameroun. 
Première Réunion du sous-groupe de Travail 
Afrique sur Phytophthora palmivora à Yaoundl. 
BLAHA (G.) - 1971 - Première approche de l’étude 
des facteurs de sensibilité par l’analyse biochi- 
mique du cortex. Première Réunion du sous- 
groupe de Travail Afrique sur P. palmivora à 
Yaoundé. 
MEIFFREN (M.), TANGUY (J.) - 1967 - Sur le rôle 
des composés phénoliques au cours de l’infection 
des cabosses de Theobroma cacao L. par P. palmi- 
VOTU Butl. C.R. Acad. SC. Paris, t. 265, pp. 1131. 
1133, 16 octobre. 
PRENDERGAST (W.N.E.) - 1965 - Studies in the 
resistance of Theobroma cacao L. to P. palmivora 
(Butl.) Butl. Thesis University of West Indies. 
Trinidad. 
RIBEREAU-GAYON (P.) - 1968 - Les composés 
phénoliques des végétaux. Dunod, Ed. Paris. 
ROCHA (H.M.), JIMENEZ (S.) - 1961 - Importancia 
de las sustancias polifenolicas en el mecanismo 
fisiologico de la resistancia de cacao (Theobroma 
cacao L.) a P. palmivora (Butl.) Butl. Turrialba 
16 (4) : 319. 
ROCHA (H.M.), MARIANO (A.H.) - 1967 - Selaçao 
de cultivares de cacau resistantes a P. pnlmivora 
(Butl.) Butl. IIe Conférence Internationale sur 
les Recherches cacaoyères. Salvador-Itabuna- 
Bahia (Brésil), 9-25 nov. 
TARJOT (M.) - 1971 - Etude anatomique de la 
cabosse de cacaoyer en relation avec l’attaque du 
P. palmivora. Communication no 1. Première 
Réunion du sous-groupe de Travail Afrique sur 
P. palmivora, Yaoundé, 18-22 oct. 
Cah. ORSTOM, sér. Biol., no 20, 1973 : 15-17 17 


Les supports biochimiques de la sensibilité et de la résistance du cacaoyer à PHYTOPHTHORA PALMIVORA : Orientation des recherches au Cameroun

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Horizon / Pleins textes