Reynaud, Pierre-Adrien

Roger, Pierre-Armand

Horizon / Pleins textes

Rev. &?col. Biol. Sol, 1977, 14 (3): 421-428 
Milieux sélectifs pour la numération des algues 
eucaryotes, procaryotes et fixatrices d’azote 
I PAR 
Pierre Adrien REYNAUD et Pierre Armand ROGER 
Centre O.R.S.T.O.M., Dakar-Halm - B.P. 1386 Dakar - République d u  Sénégal 
I. - INTRODUCTION 
4 Dans le but d‘étudier les variations absolues et relatives des Cyano- 
phycées en sol de rizière nous avons recherché une méthode et des milieux 
permettant l’évaluation optimale des Algues classées en trois catégories : 
- Algues procaryotes fixatrices d’azote ; 
- Algues procaryotes non fixatrices d’azote ; 
- Algues eucaryotes. 
A)  Choix d’une méthode de numération : 
, L’évaluation quantitative des Algues dans un milieu donné peut être effectuée par comptage direct 
au moyen d’un hématimbtre (UTERMOHL, 1958) ou par des méthodes indirectes consistant à réaliser 
des cultures A partir de suspensions-dilutions (POCHOX, 1962). 
La méthode par comptage direct permet à la fois une évaluation qualitative et quantitative de la 
flode ; elle est facilement appliquable aux eaux. Par contre elle est plus difficilement utilisable pour 
les sols car les particules minérales et organiques gênent le comptage. D’autre part cette méthode ne 
permet un isolement rapide des organismes que si l’on dispose d’un micromanipulateur. 
Les méthodes de numération indirectes font appel à l’ensemencement de tubes de milieux 
liquides ou de boîtes .de milieux gélosés au moyen de suspensions-dilutions. 
L’utilisation des milieux liquides pour la détermination du nombre le plus probable de germes 
au moyen des tables de Mac GRADY présente l’avantage de demander peu de manipulations et de 
permettre une lecture rapide. 
Toutefois cette méthode n’est pratiquement pas utilisable si l’on veut évaluer la biomasse d’une 
population hétérogène. En effet le résultat obtenu correspondra à l’espèce dont les unités de comptage 
(colonie, filament ou cellule suivant les organismes) sont les plus nombreuses et qui n’est pas forcément 
celle dont la biomasse est la plus importante. 
Reçu le 24-3-76. 
REVUE D’lkOLOGIE ET DE BIOLOGIE DU SOL VOL. 14, No 3 
422 PIERRE ADRIEN REYNAUD ET PIERRE ARMAND ROGER 
Considérons par exemple la numération d’une population composée de Chlorella sp. et de 
Spyrogyra sp. comportant cent fois moins de filaments de Spirogyres que de cellules de Chlorelles. 
Prenons comme valeur moyenne de la biomasse d’un filament de Spirogyre 7,6. 106  u3 et 3.8. lo* 
pour celle d’une cellule de Chlorelle (ROGER-REYNAUD, 1976). On voit que la biomasse des Spirogyres 
dans le mélange sera deux cent fois plus importante que celle des Chorelles alors que le nombre de 
filament de Spirogyres est égal à 10-2 fois celui des cellules de Chlorelles qui constitueront la totalité 
de la flore développée dans les tubes des deux dernières dilutions positives. 
Pour évaluer avec exactitude la biomasse du mélange il faudrait donc examiner successivement au 
nettement plus facile à réaliser après un étalement sur boîte des suspensions-dilutions. C’est donc 
cette dernière méthode que nous avons retenue. 
. 
I 
microscope tous les tubes inoculés afin de déterminer toutes les espèces présentes ; cette opération est J, 
B) Facteurs sélectifs. 
Pour évaluer de façon satisfaisante les différents composants de la flore Algale d’un biotope 
On pourra ainsi mettre en évidence les composants minoritaires masqués par les composants 
De plus on limitera les phénomènes de compétition qui peuvent être une source d’erreur dans 
Les principaux facteurs sélectifs sont les suivants : 
1 0  Azote 
donné il est préférable d’utiliser des milieux et (ou) des conditions d’incubation sélectifs. 
dominants et le comptage de chaque type d’Algue sera effectué à la dilution optimale. 
les évaluations. 
Un milieu sans source d’azote ne permet théoriquement que le développement des formes fixatrices 
(ALLEN et STANIER, 1968). 
20 Température 
Une température d’incubation élevée (350 C) favorise le développement des Algues procaryotes 
A une température plus basse (250 C) c’est l‘inverse qui se produit (ALLEN et STANIER, 1968). 
30 Antibiotiques 
L’utilisation d’antibiotiques spécifiques permet la séparation entre Algues procaryotes et Algues 
eucaryotes : 
- L’actidione (cycloheximide), inhibiteur de la synthèse de la membrane nucléaire, est sans 
effet sur les Cyanophycées alors que, suivant la concentration (1 à 200 ppm) il inhibe totalement OU 
partiellement les Algues eucaryotes (HUNTER et MCV~GH, 1961). Une concentration de 20 ppm est 
utilisée par JACKSON et CAESTENHOLZ (1975) pour éliminer les Algues Eucaryotes. 
- L’anisomycine présente des propriétés voisines mais à l’inconvénient d’être sans action sur 
certaines Algues eucaryotes telles que des Xantophycées (HUNTER et MCVEIGH, 1961). 
- A l’opposé, le chloramphénicol, utilisé à une concentration de 80 ppm, inhibe le développe- 
ment des Algues procaryotes et permet le développement des Algues eucaryotes (JACKSON et CASTENHOLZ. 
1975). DROOP (1967) l’emploie à des concentrations comprises entre 1 et 50 ppm pour purifier des 
Algues eucaryotes. 
- La bacitracine inhibe le développement des Cyanophycées à des concentrations qui sont sans 
effet sur les Chlorophycées et les Bacillariophycées (HUNTER et MCVEIGH, 1961). 
et ralentit celui des Algues eucaryotes. 
:. 
II. - MATÉRIEL ET MÉTHODES 
i 
Algues réparties en : I 
J Nous avons cherché à mettre au point des milieux sélectifs permettant le dénombrement des 
Procaryotes fixatrices 
Procaryotes non fixatrices 
Eucaryotes. 
REVUE D’ÉCOLOGIE ET DE BIOLOSIE DU SOL 
NUMÉRATION DES ALGUES EUCARYOTES, PROCARYOTES ET FIXATRICES D’AZOTE 423 
Le milieu de culture de base est le milieu BG 11 (ALLEN et STANIER, 1968) utilisé soit tel quel 
(GN) soit après omission du nitrate de sodium (GO). Ce milieu, gélosé à 1 96 est réparti à raison de 
30 ml par boîte de Pétri. Les boîtes sont inoculées par 1 ml de suspension-dilution soigneusement 
étalé au moyen d’un étaloir en verre. 
Les incubations sont faites sous une intensité lumineuse de 500 lux produite par des tubes 
au néon type lumière du jour (MAZDAFLUOR 40 W). 
Au cours de l’incubation on fait subir tous les trois jours une permutation aux boîtes de Pétri 
afin d’éliminer toute hétérogénéité due à la position relative des boites dans l’étuve. 
Les comptages sont effectués après 21 jours d’incubation sous un microscope stéréoscopique 
(Wild M5 grossissement : 15 x 12). Dans certains cas on effectue à 10 et 15 jours d’incubation des 
comptages de contrôle. 
Les différents facteurs sélectifs testés ont été les suivants : 
- Présence ou non d’azote dans le milieu de culture; 
- Actidione (cycloheximide) Sigma C-6255 ; 
- Chloramphénicol Sigma C-O378 ; 
- Bacitracine Sigma B-0125. 
Nous avons utilisé les inoculums suivants : 
- Une souche unialgale d’habaena sp. isolée d’un sol de rizière de Casamance (Sud du Sénégal) : 
- Une souche unialgale de Pseudanabaena catenata isolée d‘un sol de rizière de la région du 
- Une souche unialgale d’Aphanothece sp. isolée d’un sol de rizière de Casamance; 
- Une souche unialgale de Chlorella sp. isolée d’un sol organique submergé de la région du 
- Le mélange de ces quatre souches ; 
- Deux sols de la région du Fleuve ; 
- Pour l’étude de l’action de la bacitracine nous avons utilisé en plus huit sols de rizière 
Fleuve (Nord du Sénégal). 
Cap Vert (Sénégal); 
dont quatre sols argileux organiques et quatre sols à texture sableuse. 
III. - RÉSULTATS 
A )  Azote. 
En ce qui concerne les Algues eucaryotes et procaryotes non fixatrices 
de N2, le développement des différents inoculums testés parallèlement sur 
milieu GN et GO peut être schématiquement divisé en trois stades : 
- Pendant la première semaine d‘incubation on observe un développe- 
ment à peu près identique sur GN et sur GO. 
- Au cours de la deuxième semaine d’incubation, les Algues non fixatrices 
ne se développent plus sur le milieu GO mais gardent leur coloration. 
- Au cours de la troisième semaine on observe la décoloration des 
formes non fixatrices sur milieu GO, et après 21 jours d’incubation il n’y a 
plus d’ambiguité pour le comptage. 
En ce qui concerne les Algues procaryotes fixatrices d’azote, on observe 
une excellente corrélation entre les numérations effectuées avec et sans 
source d’azote combiné. La comparaison a porté sur quinze couples de 
valeurs ; les points se répartissent suivant une droite d’équation log y = log x 
(Fig. 1). 
VOL. 14, No 3 
424 PIERRE ADRIEN REYNAUD ET PIERRE ARMAND ROGER 
Pour chaque couple aucune valeur ne diffère significativement de l'autre : 
(ROGER et REYNAUD, 1976) le rapport de la valeur la plus &levée à la valeur la 
plus faible reste inférieur à 2 pour 13 des points et est compris entre 2 et 
2,4 pour les deux points s'écartant le plus de la droite de régression. 
10" i o 5  I O =  10' !O* 
actidlone + 
FIG. 1 (en haut à gauche). - Corrélation entre 
les numérations de différentes Algues 
procaryotes fixatrices d'azote, effectuées 
sur milieu BG 11 (GN) et sur milieu 
BG 11 privé d'azote (GO). 
Les numérations ont été effectuées à par- 
tir d'une souche unialgale, d'un mélange 
de souches unialgales et de suspensions- 
dilutions de deux sols de rizière différents. 
FIG. 2 (en haut à droite). - Corrélation entre 
les numérations de différentes Algues pro- 
caryotes effectuées sur milieu BG 11 (GN) 
et sur milieu BG 11 additionné d'actidione 
à 20 ppm (GNA). 
Les numérations ont été effectuées à par- 
N Algues eucary0tes.g-1 tir de trois souches unialgales, d'un 
104  105 108 107 106 mélange de souches unialgales et de 
suspensions-dilutions de deux sols de 
rizière différents. 
FIG. 3 (en bas). - Corrélation entre les numérations de différentes Algues eucaryotes effectuées sur 
I I I I 
Bacltraclne + 
milieu BG 11 (GN) et sur milieu BG 11 additionné de bacitracine à 15 ppm (GNB). 
Les numérations ont été effectuées B partir de suspensioIis-dilutions de 8 sols de rizière différents 
REVUE D%COLOGIE ET DE BIOLOGIE DU SOL 
NUMÉRATION DES ALGUES EUCARYOTES, PROCARYOTES ET FIXATRICES D’AZOTE 425 
Anabaena sp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  
Scytonema s p  ................................ 
Pseudanabaena catenata.. ..................... 
Oscillatoria sp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  
B ) Actidione. 
Utilisé à une concentration de 20 pg/ml, l’actidione provoque une inhibi- 
tion totale des Algues eucaryotes sur les trois types d’inoculum utilisés : 
culture unialgale, mélange de souches et sols. 
Par contre la croissance des Algues procaryotes n’est pas affectée et l’on 
observe une excellente corrélation entre les numérations effectuées avec et 
sans actidione. La comparaison a porté sui- 21 couples de valeurs (Fig. 2) ; 
les points se répartissent suivant une droite d’équation log y = log x. 
Pour chaque couple aucune valeur ne diffère significativement de l’autre : 
le rapport de la valeur la plus élevée à la valeur la plus faible reste inférieur 
à 2 pour 19 des points, et est compris entre 2 et 2,7 pour les deux points 
s’écartant le plus de la droite de régression. 
76,l 100 
100 100 
99,9 100 
100 100 
C ) Chloramphénicol. 
chloramphénicol (20-40-80 pg/ml) sur différents types d’Algues. 
Le tableau I indique le pourcentage moyen d’inhibition de trois doses de 
TABLEAU I 
Action inhibitrice de trois concentrations de Chloramphénicol sur différents types d’Algues 
eucaryotes et procaryotes. Les valeurs indiquées sont la moyenne de deux résultats expri- 
més en pourcentage d’inhibition par rapport à un témoin sans Chloramphénicol 
Concentration en Chloramphénicol pg/ml I 20 I 40 I SO I 
100 
100 
1 O0 
1 O0 
Cyanophycées unicelliilaires.. . . . . . . . . . . . . . . . .  . I  98,4 I 100 I 100 
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  85,9 97,O Diatomees - 
Chlorophycées unicellulaires.. . . . . . . . . . . . . . . . .  .I 92,s 1 93,3 I 98,O 
Chlorophycees filamenteuses.. . . . . . . . . .  . . . . . . . I  - I 9G,6 I 100 
Des concentrations de 80 et 40 pg/ml inhibent totalement le développe- 
ment des Algues procaryotes, mais provoquent également une inhibition par- 
tielle ou totale de celui des Algues eucaryotes. 
La concentration inférieure (20 pg/ml) commence à permettre un dévelop- 
pement des Procaryotes et inhibe encore celui des Eucaryotes. 
VOL. 14, No 3 
426 PIERRE ADRIEN REYNAUD ET PIERRE ARMAND ROGER 
Dans ces conditions ont voit que, bien que les Cyanophycées manifestent 
une plus grande sensibilité au chloramphénicol que les Algues eucaryotes, cet 
antibiotique ne peut être utilisé pour effectuer des numérations sélectives ; 
par contre il peut servir à purifier les Algues eucaryotes. 
D)  Bacitracine. 
Une expérience préliminaire nous a permis de déterminer la concentration 
optimale à employer (Tabl. II). 
TABLEAU II
Résultats de la numération des principaux types d’algues d’un échantillon de sol de 
rizibre sur différents milieux : 
GO = milieu BG11 sans azote - 
GN = milieu BG 11 
GNA = milieu BG11 avec actidione 20 ppm. 
GNB = milieu BG11 avec bacitracine; le chiffre placé en indice indique la con- 
centration de bacitracine en ppm. 
Les valeurs indiquées correspondent ‘au nombre de germes par cmz de sol. 
Milieux 
Diatombes. . . . . . . . .  
Chlorophycbes 
unicellulaires.. ... 
A n a b a e n a  sp . . . . . .  
Pseudana  buena 
catenata. .  . . .  
Cyanophycees 
unicellulaires.. 
Une concentration comprise entre 8 et 16 ppm est suffisante pour inhiber 
les Algues procaryotes sans affecter le développement des Algues eucaryotes. 
Les travaux de Hunter et McVeight (1961) ayant montré qu’une concen- 
tration de 50 ppm inhibe totalement le développement de certaines diatomées, 
nous avons ,choisi une concentration eRicace la plus faible possible (soit 
15 ppm) et nous l’avons testée sur dix échantillons de sol. 
Les résultats montrent que la bacitracine utilisée à une concentration 
de 15 ppm provoque une inhibition pratiquement totale des Algues procaryotes. 
Par contre la croissance des Algues eucaryotes n’est pas affectée, et l’on 
observe pour ces dernières une excellente corrélation entre les numérations 
effectuées avec et sans bacitracine (Fig. 3). 
REVUE D’ÉCOLOGIE T DE BIOLOGIE DU SOL 
NUMBRATION DES ALGUES EUCARYOTES, PROCARYOTES ET FIXATRICES D’AZOTE 427 
La comparaison a porté sur 15.couples de valeurs : les points se répar- 
tissent suivant une droite d’équation log y = log x. 
Pour chaque couple aucune valeur ne diffère significativement de l’autre ; 
le rapport de la valeur la plus élevée à la valeur la plus faible reste inférieur 
2 pour 13 des couples, et est compris entre 2 et 2,8 pour les deux points 
s’écartant le plus de la droite de régression. 
E ) Tempkrature. 
Les sélectivités de l’actidione et de la bacitracine sont largement suffi- 
santes pour ne pas avoir à utiliser deux températures différentes pour les 
numérations sélectives des procaryotes et des eucaryotes. 
Dans le cas des Algues eucaryotes l’utilisation d’une température basse 
(25O C) s’est même révélée néfaste, la croissance étant ralentie et les colonies 
étant de plus petite taille que celles qui se sont développées à 3 5 O  C, donc 
plus difficiles à compter. Ceci est à mettre en relation avec le fait que les 
espèces étudiées sont des espèces tropicales. 
c 
4 
IV. - CONCLUSIONS 
Trois milieux sélectifs ont été élaborés pour la numération des Algues 
classées en fonction de leur pouvoir fixateur et de leurs caractères 
caryotiques. 
a)  Le milieu BG 11, privé d’azote et additionné de $20 ppm d’actidione 
ne permet la croissance que des seules Cyanophycées fixatrices d’azote. Toute- 
fois les comptages ne devront être effectués qu’après trois semaines d’incuba- 
tion, des Cyanophycées non fixatrices pouvant présenter un développement 
fugace pendant les premiers temps de mise en culture. 
b )  Le milieu BG 11 additionné de 20 ppm d’actidione ne permet la 
croissance que des Algues procaryotes et est utilisé pour effectuer la numé- 
ration de la totalité des Cyanophycées. 
c)  Le milieu BG 11 additionné de 15 ppm de bacitracine ne permet la 
croissance que des Algues eucaryotes et est utilisé pour effectuer la numé- 
ration des Algues autres que les Cyanophycées. 
L’utilisation de trois milieux sélectifs oblige à tripler le nombre de 
manipulations pour effectuer la numération des Algues d’un échantillon de 
sol donné ; mais cet inconvénient est largement compensé par les avantages 
1. Mise en évidence de composants minoritaires qui seraient masqués 
2. Comptage de chaque type d’Algues effectué à la dilution optimale. 
3. Limitation des compétitions possibles entre différents groupes. 
4. Commodité d’isolement des différentes espèces. 
1 suivants : 
par les composants dominants sur milieu non sélectif. 
b 
VOL. 14, No 3 
428 PIERRE ADRIEN REYNAUD ET PIERRE ARMAND ROGER 
msuMI? \- z : 
La numération sélective des Algues classées en procaryotes fixatrices d‘azote, 
procaryotes et eucaryotes peut être effectuée respectivement sur les trois milieux 
suivants : 
- BG 11 sans azote f actidione 20 ppm 
- BG11 + actidione 20 ppm 
- BG 11 + bacitracine 15 ppm 
Cette méthode présente de nombreux avantages par rapport à la numération 
- mise en évidence des espèces non dominantes facilitée. 
- comptage de chaque type d‘Algue effectué à la dilution optimale. 
- limitation des compétitions interspécifiques. 
- isolement plus facile des colonies. 
sur milieu non sélectif : 
SUMMARY 
Selective enumeration of Algae, classified as nitrogen fixing, procaryotics and 
BG 11 without nitrogen + Cycloheximide 20 ppm 
BG 11 +- Cycloheximide 20 ppm 
BG11 + Bacitracin 15 ppm 
The advantages of this method are : 
- Easier enumeration of non dominant species. 
- Enumeration of the different groups at the optimal dilution. 
- Limitation of interspecific competition. 
- Easier isolation of algal colonies. 
eucaryotics, can be made by using the three following media, respectively : 
L- 
ALLEN (M.M.) & STANIER (R.Y.), 1968. - Selective isolation of blue-green Algae 
from water and soil. J .  Gen. MiCrobioz., 51: 203-209. 
DROOP (M. R.), 1967. - A procedure for routine purification of Algae cultures with 
antibiotics. Brit. Phycol. BUZZ., 3: 295-299. 
HUNTER (E. O.), Jr & MCVEIGHT (J.), 1961. - The effect of selected antibiotics on 
pure culture of Algae. Ani. J .  Bot., 48: 179-185. 
JACKSON (J. E.), & CASTENHOLZ (R. W.), 1975. - Habitat fidselity of thermophilic blue- 
green Algae Department of Biology, Limn. Oc., 20: 305-322. 
POCHON (J.) & TARDIEUX (P.), 1962. - Technique d’analyse en microbiologie du sol, 
111 p. Éditions de la Tourelle, 5, rue Guynemer, St-Mandé, France. 
ROGER (P.) & REYNAUD (P.), 1976. - Dynamique de la population algale au cours 
d‘un cycle de culture dans une rizière sahélienne. Rev. Ecol. BioZ. du  Sol, 
UTERMOHL (H.), 1958. - Zur Vervollkommung der quantitativen Phytoplankton 
13: 545-560. 
Metodik. Mitt. Int. Ver. LimnoZ., 9: 1-38. 
REVUE D’dCOLOGIE ET DE BIOLOGIE D U  SOL 


Milieux sélectifs pour la numération des algues eucaryotes, procaryotes et fixatrices d'azote

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