Gourevitch, Igor

Monsarrat, Pierre

Revet, Bernard

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Mise en évidence, stabilisation et purification d'une structure nucléoprotéique intracapsidaire chez le Baculovirus d'Oryctes rhinoceros L.

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C. R. Acad. Sc. Paris, t. 281 (10 novembre 1975) SBrie D - 1439 
VIROLOGIE DES INVERTÉBRÉS. - Mise en dvidence, stabilisation et puri- 
fication d'une structure nuclebprotdìque intracapsidaire chez le Baculovirus 
d'Oryctes rhinoceros L. Note (*) de MM. Pierre Monsarrat, Bernard Revet 
et Igor Gourevitch, présentée par M. Constantin Vago. 
-
La prtkence d'une structure nuclkoprotéique dans le virion du Baculovirus du coléoptère Orjates 
rhinoceros L. est montrée. Cette structure est stabilisée et purifiée. Elle se présente sous la forme d'un 
bâtonnet de 280 nm sur 15 nm contenant Ia molkcule d'ADN. Une protkine basique a kté isolke du 
virus. 
1 
En raison de sa large utilisation en lutte biologique [(') à (")I et de la mise au 
point de techniques de production de masse, le virus du coléoptère Oryctes rhinoceros 
L. représente un matériel privilégié d'étude de nombreux problèmes d'épizootio- 
logie (') et dk virologie structurale. 
Des études portant sur la pathogenèse [('),' e)' (7)], '  la structure ('), les caracté- 
ristiques de la molécule d'ADN E('), ('O)] et les relations sérologïques (") de ce virus, 
ont permis d'envisager sa classifìcation dans le groupe des Baculovirus. 
L'observation, lors des premières purifications du virus (')' '<fig: Z), de bâtonnets 
filamenteux sortant de la capside, a attiré notre attention. La difficulté à extraire les 
protéines des préparations d'ADN du virus ainsi que les caractéristiques particulières 
de cette molécule [('O), (")I ndus ont conduits à développer l'étude de ces structures, 
filamenteuses et à concevoir une technique pour leor extraction. 
L'examen des modifications de ces filaments montre'ùn passage continu du 
bâtonnet au déploiement complet de lá molécule d'ADN (fig. 1, 4,' 5 )  ce qui nous 
incite à attribuer à cette structure la valeur d'une nucléoprotéine organisée. - 
I OBTENTION Du VIRUS. - Le virus-est obtenu à partir de déjections d'adultês 
recueillies dans un tampon phosphate M, pH 8,5, contenant 121 zde-saccharose 
et'divers antibiotiques ('"). La quantitékde virus produite par cette technique a pu 
Qtre estimée sur larves de 2 e  stade à lo9 DL 50 par adulte et par jour. Le virus est 
purifié par un cycle de centrifugations en gradients de saccharose, suivant la technique 
précédemment décrite ('). 
DBGRADATION &NAGBE DU VIRUS. - Sous l'action du thioglycolate de sodium 
à pH basique, la particule virale subit une dégradation progressive. 
Après 1 h d'action du réducteur, l'observation en microscopie électronique, 
après coloration à l'acétate d'uranyle 4 %, montre que la plupart des particules sont 
pénétrées par le colorant. 
Sur les particules les moins dégradées, la nucléoprotéine apparaît comme un 
filament adhérent A une extrémité de la capside et placé entre celle-ci et l'enveloppe. 
La lyse compl&te de la capside libère le filament dans l'enveloppe et par rupture 
de celle-ci dans le milieu. ! 
%.- 
1440 - Série D C: R. Acad. Sc. Paris, t. 281 (10 novembre 1975) 
STABILISATION DE LA STRUCTURE NUCL~OPROTÉIQUE. - Après différents essais, 
il nous est apparu que la stabilité de la structure native nucléoprotéique dépend de 
trois facteurs principaux : le pH, la force ionique et le rapport des quantités de virus 
et de mélange réducteur. 
La structure de la nucléoprotéine libérée est stable pendant plusieurs jours en 
utilisant, pour la dégradation du virus, une solution de thioglycolate 0,l M et car- 
bonate de sodium 0,7 M à pH 10’2 maintenue à 40. Les proportions respectives du 
mélange basique réducteur et de virus sont de 4 volumes pour 1 volume de suspension 
virale de 10 de D. O. à 260 nm. 
PURIFICATION DE LA STRUCTURE NUCLÉOPROTÉIQUE. - Par centrifugation 
dsérentielle de suspensions &ales incubées 14 h dans le mélange réducteur, nous 
obtenons des préparations de nucléoprotéines. 
Le surnageant d’une première centrifugation de 60 mn à 114 O00 g est m i s  au 
culot pendant 2 h à 300 O00 g sur un rotor a SW 50. I D. L‘examen de suspension du 
dernier culot montre qu’il est essentiellement composé de nucléoprotéines (Jig. 6). 
Une purification plus complète est obtenue en répétant sur cette suspension le 
cycle des deux centrifugations. 
La purification de la nucléoprotéine est aussi obtenue directement en plaçant 
la suspension de virus dégradée au sommet d’un gradient de saccharose 0-45 % 
poids/poids reposant sur un coussin de saccharose 60 % poids/poids. Les solutions 
,de saccharose sont faites dans le mélange réducteur à pH 10’2. Après centrifugation 
de  15 h à 300 O00 g la nucléoprotéine est recueillie au niveau du coussin. Une bande 
formée par les enveloppes vides apparaît dans le gradient. 
L’examen au microscope électronique de préparations de nucléoprotéines 
montre qu’elles se présentent sous la forme de bâtonnets assez rigides d’environ 
.280 nm sur 15 nm. Une structure de surface composée de sous-unités placées selon 
;une symétrie hélicoïdale paraît probable (Jig. 3). 
L’examen après étalement des particules virales selon la technique décrite par 
Dubochet (’ 3), suivi d’un ombrage rotatif au platine, révèle la présence d’une struc- 
ture en hélice du bâtonnet, lorsque celui-ci s’est trouvé éjecté de la 
capside (Jig. 1 et 4). 
EXPLICATION DE LA PLANCHE 
hzbarres représentent 0,l p. ‘ 
Fig. 1,4 et 5. - Structures nucléoprotéiques sortant de la capside virale. Coloration acétate d’uranyle 1 ’% 
Fig. 2. - Strycture nucléoprotéique. Coloration négative, acétate d’uranyle 4 %. 
Fig. 3. - Détail d‘une partie de,structure N. P. dans les conditions de stabilisations. Coloration négative, 
Fig. 6. - Préparation de structures nucléoprotéiques. Coloration négative, ,acétate d‘uranyle 4 %. 
t 
et ombrage rotatif aprks ëtalement par la technique de Dubochet. < 
I I  acétate d’uranyle. 4 %. 
PLANCHE I. M. PIERRE MONSARRAT. 
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Série D - 1441 . C. R. Acad. Sc. Paris, t. 281 (10 novembre 1915) 
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1 DISCUSSION. -Des structures nucléoprotéiques organisées, participant à 
l'architecture générale du virus et indépendantes de la capside, n'ont été décrites, à 
notre connaissance, que chez certains Rhabdovirus ('") et chez deux Arbovirus [(l'), 
(16)]. Parmi les virus à ADN la présence d'une structure morme  considérée comme 
liée à la capside a été notée dès 1964 chez un Baculovirus (l') par Vago et étudiée 
par Ponsen ('*). La présence d'une structure en bâtonnet interne à la capside avait 
été observée chez un Baculovhus (l') après action du PTA 10 % ou de la chaleur. 
C'est donc la première fois, à notre connaissance, que de telles structures ont 
pu être isolées, purifiées et caractérisées chez un virus à ADN. Elles paraissent diffé- 
rentes de celles des riboprotéines d'Arbovirus et de Rhabdovirus précédemment 
décrites [(l"), (15), ("71. 
Par électrophorèse en gel de polyacrilamide (") de suspensions de virus dégradés, 
nous avons pu mettre en évidence l'existence d'une protéine basique dont la vitesse 
de migration se situe entre celle des histones et des protamines. I1 paraît probable 
qu'il s'agisse de la protéine associée à l'ADN dans la structure nucléoprotéique. 
Les images obtenues par dégradation ménagée de la protéine constituant la 
nucléoprotéine, rendent possible l'étude de la configuration de la molécule d'ADN 
qui mesure 40 1.1 dans la structure nucléoprotéiqùe. Ce travail est actuellement en 
cours. Les dimensions respectives de la nucléoprotéine et de la capside permettent 
d'envisager des possibilités d'organisation de la nucléocapside virale. 
L'obtention, lors de la purification des nucléoprotéines, de fractions très enri- 
chies en enveloppes ou en protéines d'origine capsidaire, devrait permettre de 
rapporter à des structures précises un certain nombre de protéines constitutives de la 
particule virale. La possibilité de purification de quantités importantes de la protéine 
liée à l'ADN ouvre, en outre, des voies d'études en ce qui concerne les interactions 
ADN-pr o téines. 
(*) Séance du 22 septembre 1975. 
Travail réalise dans le cadre d'un programme FAO. 
(1) A. HUGER, Z. Angew. Entomol., 72, 1972, p. 309. 
(2) B. ZELAZNY, J. Invert. Puthol., 22,1973, p. 122 et 359. 
(3) C.  HAMMES, Cuh. ORSTOM, série Biol., 21, 1974, p. 90. 
(4) P. MONSARRAT, Cah. ORSTOM, série Biol., 21,1974, p. 91. 
(5) P. MONSARRAT, J.-L. DUTHOIT et C.  VAGO, Comptes rendus, 278, Série D, 1974, p. 3259. 
(9 P. MONSARRAT, G. MEYNADIER, G. CROIZIER et C .  VAGO, Comptesrendus, 276, Série D, 1973, p- 2077. 
(7) J. M. QUIOT, P. MONSARRAT, G. MEYNADIER et C.  VAGO, Comptes rendus, 276, Série D, 1973, 
(8) P. MONSARRAT, J. C.  VEYRUNES, G. MEYNADIER, G. CROIZIER et C.  VAGO, Comptes rendus, 277,. 
(9) B. REVET et P. MONSARRAT, Comptes rendus, 278, Série D, 1974, p. 331. 
(10) C.  PAYNE, J. Gen. virol., 25, 1974, p. 105. 
(11) G. CROIZIER et P. MONSARRAT, Entoniophaga, 19, 1974, p. 115. 
(12) P. MONSARRAT et J. C.  VEYRUNES, J. Invertebr. Puthol. (sous presse). 
(13) J. DUBOCHET, M. DUCOMMUN, M. ZOLLINGER et E. KELLENBERGER, J. Ultrastr. Res., 35, 1971, 
p. 3229. 
Série D, 1973, p. 1413. 
p. 147. 
~ 1442 - SCie D C.'R. Acad. Sc. Paris, t. 281 (10 novembre 1975) 
(14) K. H w L e R ,  in : Comparative Virology, K. Maramorosch et E. Kurstak, Academic Press, 1971, 
(15) R. F. PETTERSSON et C.  H. VON BONSDORFF, J. of. Viro!., 15,2,1975, p. 386. 
(16) A. SAMCO, M. BOULOY et C. HANNOTJN, Comptes rendus, 280, SBrie D, 1975, p. 779. 
(17) C. VAGO, Rev. de Path. Veg. et Ent. Agr. de Fr., 43 (4), 1964, p. 237. 
~(18) M. B. PONSEN, eth. J .  Plant. Path., 71,1965, p. 54. 
,(19) N. G. SHVEDCHIKOVA, B. P. ULANOV et L. M. TARASEVITCH, Vopz. Virusol. URSS, 5,1968, p. 631. 
(20) S. PANYIM et R. CHALKLeY, Arch. Biochem. Biophys., 130, 1969, p. 337. 
p. 361. 
QRSTQM, 70-74, route d'Aulnay, 93140 Bondy ; 
Station de Recherches de Cytopathologie, 
INRA-CNRS, 30380 Saint-Christo1 ; 
Institut de Recherches sur le Cancer, 
avenue Paul- Vaillant-Couturier, 94800 Villejuif ; 
34060 Montpellier Cedex. 
de Recherches no 140 du CNRS-USTL, 


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