Bangratz, J.

Chrestin, Hervé

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C. R. Acad. Sc. Paris, t. 296 (10 janvier 1983) Série III - 101 
PHYSIOLOGIE CELLULAIRE VÉGÉTALE. - Une activité enzymatique endogène 
NAD ( P )  H dépendante, responsable de la dégradation peroxydative des organites 
membranaires et de la coagulation précoce, ou in situ, du latex $Hevea brasiliensis. 
Note (*) de Hervé Cretin et Jacques Bangratz, présentée par Roger Buvat. 
Les lutoïdes, vacuo-lysosomes du latex d’Hévéa, renferment une activité enzymatique génératrice d’anions 
superoxydes (O,) NAD(P) H dépendante. L’émission des divers radicaux toxiques de l’oxygène qui en résulte, 
provoque la dégradation peroxydative des lipides insaturés membranaires, la lyse des organites et la 
décompartimentation consécutive des facteurs coagulants du latex. 
Cette activité peroxydative est particulièrement intense au niveau des lutoïdes provenant d’Hévéas atteints 
d’cc encoches sèches n et serait à l’origine de la coagulation du latex à l’intérieur des laticifères, phase ultime de 
ce syndrome. 
PLANT CELL BIOCHEMISTRY. - An Endogenous NAD(P) H Dependent Enzymatic Activity, 
Responsible for the Peroxidative Degradation of Organelle Membrane and for the Early, as Well as in situ, 
Coagulation of the Latex of Hevea brasiliensis. 
The lutoïds, vacuo-lysosomes f iom the hevea latex, contain an enzymatic activity that generates superoxide anions 
from NAD ( P )  H and 02. The diverse toxic forms of oxygen that are emitted lead to the peroxidatic degradation 
of the membrane unsaturated lipids, then organelle lysis and the consecutive decompartmentation of the coagulating 
factors of tile latex. This NAD ( P )  H dependent peroxidatic activity is particularly severe in the lutoïds fioin hevea 
with “dry-cuts” (brown bast) syndrome, and is probably responsible for the internal coagulation of the latex within 
the bark: the ultimate stage of this syndrome. 
Le latex &Hevea brasiliensis est le cytoplasme d’un réseau de cellules spécialisées (les 
laticifères), situé dans le phloème de l’arbre. Une simple blessure de l’écorce, la c( saignée B, 
suffit à provoquer son épanchement, jusqu’à ce que des phénomènes de coagulation 
viennent obturer l’extrémité des laticifères et arrêter son écoulement [ 11. La coagulation 
du latex sur a l’encoche de saignée )) constitue de ce fait le facteur limitant principal de la 
production du caoutchouc d’Hévéa. De plus, dans certains cas de surexploitation des 
arbres [2], la saignée de l’écorce ne s’accompagne plus de Pépanchement du latex : ce 
phénomène de c( tarissement D, connu sous le nom d‘a encoches sèches D, correspondrait 
à la coagulation du latex à l’intérieur même des laticifères [3]. 
I1 est maintenant bien admis que la quasi-totalité des facteurs entraînant la coagulation 
du latex sont compartimentés à l’intérieur des organites de ce cytoplasme, les lutoides 
microvacuoles à caractère lysosomal ([4] à [7]), et les particules de Frey-Wyssling [8]. On 
conçoit dès lors l’extrême importance de l’intégrité des membranes constituant ces 
organites, et il est alors intéressant de rechercher les causes expliquant leur plus ou moins 
forte instabilité. 
La présente Note confirme l’extrême fragilité des particules du latex provenant d’Hévéas 
très bas producteurs ou atteints d’cc encoches sèches D. La déstabilisation de ces organites 
est expliquée par la dégradation peroxydative deJeurs lipides insaturés membranaires, due 
la présence d’une activité lutoidique NAD (P) H dépendante, libérant des radicaux 
superoxyde dans le milieu. 
MÉTHODES. - Le latex provient d’Hévéas du clone GT. 1, sélectionnés et répartis en 
groupes selon leur productivité en caoutchouc sec et la présence ou non de symptômes 
avancés d’cc encoches sèches D. Les échantillons, récoltés individuellement dans des tubes 
plongés dans la glace fondante sont immédiatement centrifugés à 70000 g durant 1 h. La 
phase aqueuse correspondant au cytosol ou sérum cytoplasmique, est prélevée et conservée 
dans la glace, pour analyses. La phase sédimentée, constituée essentiellement des lutoides, 
L‘I DEC. 4983 
Q. w. s. 1. o. M, Gonds ~~~~~~~~~~~~~ 
h 
102 - Série III C. R. Acad. Sc. Paris, t. 296 (10 janvier 1983) 
est (( purifiée >) ou non par trois lavages/centrifugation successifs avec un tampon 
Mannitol 0,3 My Tris-HCL 50 mM à pH 7,4. 
L’indice d’éclatement des lutoydes a été mesuré en déterminant les activités phosphatases 
acides lutoydiques (( libres >> et (( totales >> selon la technique décrite par Ribaillier [5]. La 
séparation des organites du latex sur gradient de saccharose, les électrophorèses sur gel 
d’amidon et les mesures des activités o-diphénoloxydases ont été réalisées selon les 
techniques décrites par Brzozowska et coll. [8]. La consommation d’oxygène NAD (P) H 
dépendante a été mesurée à l’aide d‘un oxygraphe équipé d‘une électrode de type Clark. 
L’oxydation du NADH a été suivie au spectrophotomètre, à 340 nm [9] et la production 
des radicaux superoxydes estimée selon la méthode de Beauchamp et Fridovich [lo]. Le 
dosage des thiols réduits cytoplasmiques a été effectué par la méthode à l’acide di-thio- 
bis-nitrobenzoïque [ 111, celui du malondialdéhyde (MDA), sous produit de la peroxydation 
des lipides insaturés, au moyen de l’acide 2-thiobarbiturique selon la méthode de Stancliff 
et coil. [12]. 
RÉSULTATS ET DISCUSSION. - La figure 1 montre l’existence d’une corrélation négative 
très hautement significative ( r =  -0,839) entre la productivité des Hévéas (Ln de la 
production) et l’indice d’éclatement de leurs lutoïdes. Les arbres atteints du syndrome 
d’e. encoches sèches >) se caractérisent par les indices d’éclatement lutoïdiques les plus 
élevés. 
L’analyse des activités o-diphénoloxydases, normalement compartimentées dans les 
particules de Frey-Wyssling sédimentables ([ 131, [8]) met en évidence leur apparition dans 
le sérum cytoplasmique des arbres atteints d’encoches sèches (tableau). Une vérification 
EXPLICATION DE LA PLANCHE 
Fig. 1. - Corrélation entre la productivité des Hévéas, exprimée par le logarithme népérien de la production en 
grammes de caoutchouc sec par saignée (g/a/s) et l’indice d’éclatement (IE en %) de leurs lutoïdes. (* : arbres 
atteints d’(( encoches sèches n). 
Fig. 1. - Correlation between latex yield (NaturaP logarithm grams dry weightltree and tapping) and the bursting 
index (IE in %) of lutoïds. (* : “dry-cuts” syndrome). 
Fig. 2. - Corrélation entre l’indice d’éclatement des lutoïdes et leur consommation d‘Oz NADH dépendante. 
Fig. 2. - Correlation between the bursting index of the lutoïds and their DPNH dependent oxygen consumption. 
Fig. 3. - Corrélation entre la productivité des Hévéas (g/a/s) et la teneur en composés thiols réduits 
Fig. 3. - Correlation between latex yield (grams dry weight/tree and tapping) and the thiol group content (RSH)  
Fig. 4. - Inhibition simultanée de la consommation d’O2 lutoïdique et de l’émission de superoxydes, par la 
Fig. 4. - Parallel inhibition of the oxygen consumption and the superoxide emission by lutoïds, in the presence of 
cytoplasmiques de leur latex (mM). 
of their latex cytosol (mM). 
superoxyde dismutase et la catalase exogènes (10 unités/ml). 
exogenous superoxide dismutase and catalase (10 unitslml). 
Fig. 5. -Consommation d’O2 (en pl) et du NADH (DO-340 nm) par des lutoïdes d’Hévéas atteints d’cc encoches 
sèches D en suspension dans un tampon isotonique à pH 7,4. Apparition simultanée de malondialdéhyde 
(DO-532 nm), sous-produit de la peroxydation de l’acide linolénique exogène, et évolution concomitante de 
l’indice d’éclatement des lutoïdes (I.E. : %). 
Fig. 5. - Oxygen consumption (pl) and DPNH oxidation (OD-340 nm) by lutoïds from Hevea with “dry-cuts” 
syndrome, in an isotonic buffer, pH 7.4, Simultaneous malondialdehyde emission (OD-532 nm), a by-product 
of linolenic acid peroxidation, and lutoidic bursting index increase. 
H E R V ~  CRETIN 
I- 
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15 30 45 
INDICE D'ECLATEMENT % 
Fig. 1 
z 
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n 
2 
U 
=I 
8C 
40 
. . ,I 
: .I' * . . .  . ,7'- 1 . 
* ,i 
I' % 
2 3 4 . 
THIOLS REDUITS CYTO. mM 
D0.532 I.E.% 
4 
Fig. 3 
LUTOIDES NADH SOD CATALASE 
I I  I I 1 
Consommat ion 
- 
01 U.DO i 
560nm i Emission d'oz .' 
......' .... . ....... . ..... * 4 5  minutes + * 
Fig. 4 
d 
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par électrophorèse sur gel d'amidon montre que ces enzymes, retrouvés dans le cytoplasme, 
sont effectivement originaires des particules de Frey-Wyssling. Leurs activités sont 
toutefois largement sous évaluées compte tenu du pouvoir inhibiteur (70 à 90 %) du sérum 
cytoplasmique [SI. Ainsi la diminution des activités sédimentables corrélative à 
l'augmentation des activités cytoplasmiques, traduit bien la lyse des particules de Frey- 
Wyssling dans les latex provenant d'arbres c( malades D. 
L'ensemble de ces résultats confirme l'instabilité extrême des organites du latex 
provenant des Hévéas atteints d'cc encoches sèches B, et dans une moindre mesure des 
arbres à coagulation précoce, très bas producteurs. 
Nous avons recherché s'il existait dans ces latex, un mécanisme biochimique susceptible 
de rendre compte de la déstabilisation de ces organites in situ. 
Nous avons mis en évidence dans le sédiment lutoïdique du latex une activité NAD (P) H 
oxydase génératrice de formes éminemment toxiques de l'oxygène, liée positivement 
(Y= +0,608) à l'indice d'éclatement des lutoïdes ( j ig .  2). Les activités les plus élevées 
caractérisent les lutoïdes les plus instables des arbres atteints d'a encoches sèches et dans 
une moindre mesure des arbres très bas producteurs. Cette activité enzymatique localisée 
au niveau des lutoïdes se traduit par une absorption d'oxygène NAD (P) H dépendante 
insensible aux inhibiteurs classiques des chaines respiratoires mitochondriales ou 
microbiennes et l'émission d'anions superoxydes (O;) résultat du transfert direct d'une 
partie des électrons du NAD(P) H sur l'oxygène moléculaire dissous (Jig. 4). 
L'addition de superoxyde dismutase ([14], [15]) et de catalase inhibe à la fois l'absorption 
d'oxygène et la réduction du bleu nitré de tetrazolium, ce qui confirme l'émission de 
radicaux superoxydes et d'eau oxygénée par le système. 
Ce système enzymatique montre une activité optimale à pH neutre, il est activé par des 
concentrations physiologiques en Fe3+ ou Cu2+. 
L'addition, in vitro, de NADH (0,5 mM) à une suspension lutoïdique purifiée provenant 
d'arbres atteints d'cc encoches sèches B se traduit par une intense consommation d'oxygène 
corrélative à la disparition du NADH exogène, et par une très forte augmentation de 
l'indice d'éclatement des lutoïdes. Le même type d'expérience réalisé en présence $acides 
gras insaturés exogènes aboutit à la libération de malondialdéhyde, sous produit de la 
dégradation peroxydative de ces acides gras (Jig. 5)  ; ces activités restent à peine décelables 
au niveau des lutoïdes provenant d'arbres sains, haut-producteurs. 
Des analyses portant sur la présence de cc protecteurs )) endogènes susceptibles de 
détoxifier le latex vis-à-vis des différentes formes aggressives de l'oxygène ont permis de 
démontrer la présence de superoxyde-dismutases [14] et de confirmer la présence de 
catalases dans les différents compartiments du latex [13]. Les arbres atteints d'cc encoches 
sèches )) se caractérisent par une diminution significative de ces activités protectrices 
TABLEAU 
Libération des activités ortho-diphénol oxydases (O-DPox) des particules de Frey-Wyssling sédimentables (Sed.) 
dans le cytosol du latex d'Hévéas atteints d ' c c  encoches sèches 1) (DO/O,l ml/mn). 
Release of the o-diphenol oxidase activities (O-DPox) from the sedimentable Frey- Wyssling particles (Sed.), 
in the cytosol of the latexfrom Hevea with "dry-cuts'' syndrome (OD/O.l mllmin.). 
O-DPox-Sed. O-DPox-cyto. 
.................... 0, 00 Arbres sains. 1,63 
(( encoches sèches )) (30%) . . . . . . . . . . . .  O, 63 0,054 
(( encoches sèches )) (70%) . . . . . . . . . . . .  0,49 0,168 
106 - Série III C. R. Acad. Sc. Paris, t. 296 (10 janvier 1983) 
~ 
enzymatiques. D'autre part, nous avons pu mettre en évidence une corrélation positive 
hautement significative entre la productivité des arbres ( r  = 0,685) (Jig.  3), et la teneur en 
thiols réduits cytoplasmiques, capteurs potentiels de certaines formes toxiques de 
l'oxygène [16]. 
Ainsi, la coagulation précoce du latex sur l'encoche de saignée de même que la 
coagulation in situ dans le cas d'arbres atteints d'<c encoches sèches )) correspond à une 
forte instabilité des membranes constitutives des organites figurées du latex et s'explique 
chronologiquement par : 
- le démasquage d'activités enzymatiques génératrices de formes très toxiques de 
l'oxygène, accompagné d'une diminution des protecteurs endogènes ; 
- la dégradation peroxydative des lipides membranaires insaturés ; 
- la déstabilisation consécutive de certaines membranes biologiques. 
L'une des conséquences en est la décompartimentation des agents coagulants présents 
sous forme latente dans les organites, suivie de la coagulation précoce du latex sur 
, l'encoche chez les Hévéas bas-producteurs, et à l'intérieur de l'écorce chez les arbres 
atteints d'cr encoches sèches D. 
(*) Remise le 7 juin 1982, acceptée après révision le 22 novembre 1982. 
[l] W. A. SOUTHORN, J. Rubb. Res. Inst. Malaya, 21, 1969, p. 494. 
[2] J. BRZOZOWSKA-HANOWER, H. CRETIN, P. HANOWER et P. M HEL, Physiol. Veg., 17, 1979, p. 851. 
[3] E. DE FAY et C. HEBANT, Comptes rendus, 291, série D, 1980,l. 865. 
[4] S. F'UJARNISLCE, Thèse $&tat Sc. Nat., 1969, Orsay, A.O. 3379. 
[5] D. RIBAILLIER, Thèse d'Étut Sc. Nut., 1972, Abidjan, A.O. 7716. 
[6] W. A. SOUTHORN et E. E. EDWIN, J.  Rubb. Res. Inst. Malaya, 20, 1968, p. 187. 
[A P. HANOWER, J. BRZOZOWSKA et C. LIORET, Physiol. Veg., 14, 1976, p. 677. 
[SI J. BRZOZOWSKA-HANOWER, P. HANOWER et C. LIORET, Physiol. Veg., 16, 1978, p. 231. 
[9] H. U. BERGMEYER, Methods in Enzymatic Analysis, 2' éd., Acad. Press, 1965, p. 1011. 
[lo] C. BEAUCHAMP et I. FRIDOVICH, Anal. Biochem., 11, 1971, p. 276. 
[l l]  G. L. ELIMANN, Arch, Boochem. Biophys., 82, 1959, p. 70. 
[12] R. C. STANCLIFF, M. A. WILLIAMS, K. UTSUMI et L. PACKER, Arch. Biochem. Biophys., 131, 1969, p. 629. 
[13] M. COUPE, S. PUJARNISCLE et J. D'AUZAC, Physiol. Veg., 10, 1972, p. 459. 
[14] I. FRIDOVICH, Ado. Enz., 41, 1974, p. 45. 
[15] K. L. FONG, P. B. MCCAY et J. C. POYER, J. Biol. Chem., 248, 1973, p. 7792. 
[16] D. S. TARBELL, Organic Sulfur Compounds, N. KHARASCH, éd., Pergamon Press, 1, 1961, p. 97. 
Laboratoire de Physiologie végétale, 
O.R.S.T.O.M., B.P. V-51, Abidjan, Côte-d'Ivoire. 


Une activité enzymatique endogène NAD(P)H dépendante, responsable de la dégradation peroxydative des organites membranaires et de la coagulation précoce ou in situ, du latex d'Hevea brasiliensis

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