Dollet, Michel

Fauquet, Claude

Thouvenel, Jean-Claude

Horizon / Pleins textes

Ann. Phytopafhol., 1978, 10 (I), 93-99. 
i’ 
Influence du p H  sur le Virus der Clump (I) de l’Arachide 
(Peanut Clump Virus) et nouvelle me‘thode rapide de purification 
J.-C. THOUVENEL, C. FAUQUET et M. DOLLET* 
Loborofoire de Virologie, Sfofion ORSTOM d’Adiopodoumé, 
BP V 51, Abidjan, Côfe-d’Ivoire. 
* (IRHO) Sfofion de Recherche de Pofhologie Comparée, 1.N.R.A.-C.N.R.S., 
30380 Sf-Chrisfol-Iès-Alès. 
RBsumé 
Le point iso-électrique du Virus du Clump de l’Arachide (Peanut Clump Virus) a été déterminé. 
La stabilité du virus à différents pH a été étudiée d’après la variation du pouvoir infectieux. Ces 
données ont permis de mettre au point une méihode rapide de purification du virus après une clarifi- 
cation par acidification. 
Introduction 
L‘agent causal du Clump de l’Arachide a été identifié comme étant un virus 
en bâtonnetà deux composants (Thouvenel ef al., 1974). Une méthode de purification 
par précipitation au PEG après clarification au butanol-chloroforme a été mise au 
point malgré des difficultés dues à l’agrégation du virus (Thouvenel ef al., 1976). 
Le présent article, conçu à partir des résultats de mesure du point iso-électrique du 
virus, explique en partie ces phénomènes d’agrégation. L’étude de l’influence du pH 
sur I’infectivité des particules virales a permis en outre de mettre au point une méthode 
rapide de purification du virus en clarifiant le  broyat de plantes malades par acidifica- 
tion. 
Matériel et méthodes 
Le virus est multiplié sur Chenopodium amaranticolor en serre vitrée à une tempéra- 
ture moyenne de 30 à 35 OC. Pour I’étude de la stabilité en fonction du pH et la déter- 
mination du point iso-électrique, le  virus est purifié selon la méthode décrite précédem- 
ment (Thouvenel et al., 1976). 
Le pouvoir infectieux est éprouvé par inoculation sur C. amaranficolor et sur 
Arachis hypogea après saupoudrage des feuilles avec du carborundum. Le chénopode 
réagit localement à l’inoculation, mais de manière semi-systémique (Thouvenel ef al., 
(1) Le nom de c< Clump,,, déjà couramment utilisé en Français depuis 1931 pour désigner cette maladie, aété 
2 7 OCT. 1978 conservé pour éviter la confusion avec le Virus du Rabougrissement de l’Arachide (Peanut Stunt Virus). 
8% sm v. om M, 
94 J.-C. THOUVENEL, C. FAUQUET, M. DOLLET 
1976). Les lésions chlorotiques difficilement visibles se rejoignent et envahissent 
toute la feuille, devenant de plus en plus apparentes avec le  temps. Pour cette raison, 
seuls le  temps nécessaire à l’apparition d’un symptôme et le nombre de feuilles qui 
réagissent sont notés. 
Le point iso-électrique du virus a été déterminé par électro-focalisation sur une 
colonne LKB de 110 ml, avec un gradient d’ampholytes de pH 3,5 à pH 10. Pour 
chaque expérience une charge de 2 à 3 mg de virus dans de l’eau bidistillée a été 
déposée sur la colonne. La colonne est maintenue sous une tension de 300 V jusqu’à 
stabilisation de l’intensité du courant à un minimum pendant 24 h (soit environ 72 h 
au total). Le gradient est récolté par le bas en cent dix fractions de 1 ml, et la densité 
optique à une longueur d’onde de 280 nm enregistrée à la sortie de la colonne au 
moyen d’un Uvicord II LKB muni d’une cellule à flot continu de 0,l ml. Le pH de 
chaque fraction est mesuré au moyen d’un pH mètre Tacussel Is is  4000. La super- 
position des deux courbes indique le point iso-électrique du virus. 
Pour I’étude de la stabilité du virus en fonction du pH, nous avons repris la 
méthode utilisée par Haviarova et Valenta en 1972 dans I’étude du <( Red Clover 
Mottle Virus )). Les tampons, utilisés à la molarité de 0,025 M, sont les suivants : 
- pH 1, pH 2 : Acide chlorhydrique - Chlorure de p.otassium. 
- pH 3 à pH 5 : Tampon citrate. 
- pH 6 à pH 8 : Tampon phosphate. 
- pH 9 : Tampon borate. 
- pH 10 et pH 11 : Tampon borax - Soude. 
Fraction s 
FIG. 1. - Elecfro-focalisofion sur grodienf d’ampholyfes pH 3,5 d pH I O .  
Electro-focusing on gradienf ofampholyfes pH 3.5 fo pH I O .  
~ : Densité optique h 280 nm (Optical density at 280 nm). +++ : Mesure du pH fraction par fraction (Measure of pH value of each fraction). 
INFLUENCE DU pH SUR LE PCV 95 
1 ml de virus purifié (0,l UDO) dans du tampon borate de sodium 0,05 M, pH 8, 
contenant 0,001 M d’EDTA, est dialysé pendant 24 h à 6 OC, contre 300 ml de tampon 
à pH désiré (le tampon est renouvelé deux fois) ; puis le virus est dialysé à nouveau 
pendant 24 h contre du tampon borate de sodium 0,025 M, pH 8, dans les mêmes 
conditions. Pour chaque valeur de pH, le virus est ensuite dilué à 10-1, 10-2, 10-5 
et et chaque dilution est inoculée sur cinq feuilles de quatre plants de C. amaran- 
ficolor. 
Les spectres d’absorption du virus purifié sont réalisés au moyen d’un spectro- 
photomètre Zeiss PMQ II. 
Résultats 
1. - Déterminafion du poinf iso-élecfrique 
Le virus précipite sous forme d’un anneau visible dans le grqdient d’ampholyte. 
Le point ¡so-électrique du Virus du Clump de l’Arachide est de 6,45 & 0,lO (fig. 1). 
L’inoculation du virus récupéré à la sortie de la colonne à C. amaranticolor et 
A. hypogea montre que celui-ci était infectieux. 
2. -Stabilité en foncfion du pH 
Le virus conserve la majorité de son pouvoir infectieux après 24 h à pH 5, pH 6, 
pH  7 et pH 8, avec un maximum de stabilité à pH 6. II perd tout pouvoir infectieux 
après 24 h en dessous de pH 3 et au-dessus de pH 10 (tabl. 1, fig. 2). 
TABLEAU 1 
lnfecfivifé du Virus du Clump de l’Arachide mainfenu 24 h d diférenfs pH. Le résulfaf donné esf celui du 
Ile j après inoculafion. II esf mesuré par le nombre de feuilles avec sympfômes sur 20 feuilles de C. 
amaranticolor inoculées 
lnfecfivify of fhe Peanuf Clump Virus mainfained 24 h of diferenf pH values. The results of fhe elevenfh day 
after inoculafion are given. They are measured by fhe number of infecfed leoves on 20 leaves inocu- 
Iafed 
- 
Dilution d e  I’inoculum Non 
10-1 10-2 10-3 10-4 
PH 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
9 
11 
11 
O 
O 
20 
20 
20 
20 
20 
20 
15 
1 
O 
O O O O 
O O O O 
15 1 O O 
20 5 O O 
20 8 3 O 
20 18 4 7 
20 11 1 O 
20 14 1 O 
16 9 O O 
1 O O O 
O O O O 
Annales d e  Phytopathologie. - 1978 7 
96 J.-C. THOUVENEL, C. FAUQUET, M. DOLLET 
------- ---- 
PH 
FIG. 2. - Etude de lo sfobilifé du Virus du Clump de l'Arachide. La variation du pouvoir infectieux est 
rapportée au temps d'apparition des symptômes sur les plantes-tests, inoculées avec une gamme 
de dilution de chaque échantillon maintenu 24 h au pH déterminé. En abscisse de gauche h droite : 
valeurs du pH. En abscisse de bas en haut : date d'apparition des symptômes sur les plantes 
inoculées. En ordonnée : dilution de I'inoculum. 
Sfudy of fhe sfabilify of fhe Peanut Clump Virus according io  fhe pH. The evolution of the infectivity of 
each virus batch, maintained durinq 24 hours at a given pH value, i s  measured daily with the 
reaction of test plants, inoculated 4 t h  successive dirution 'of each batch. 
i 
3. - Méthode de purifrcafion 
La conservation du pouvoir infectieux du virus, malgré l'exposition à des pH 
faibles, nous a conduit à éprouver I'acidification en tant que méthode de clarification. 
Ceci nous a permis de mettre au point une méthode rapide de purification. 
1 
I 
INFLUENCE DU pH SUR LE PCV 97 
Les feuilles de C. amaranticolor congelées sont broyées pendant 2 min au Waring- 
Blendor en présence de tampon borate de potassium 0,2 M, pH 8,2, contenant de 
l’urée 1 M, de I’EDTA 0,Ol M et du mercapto-éthanol 0,5 p. 100 (2 ml de tampon/g). 
Après passage sur étamine, le filtrat (pH 8 environ) est acidifié à pH 4,2 à l’aide d’acide 
citrique 2 M, et conservé 30 min dans de la glace. A l’aide de potasse 6 N, le pH est 
remonté à 8,2 ; le  broyat est alors centrifugé 10 min à 10 O00 g. Le pH du surnageant, 
après adjonction de 4 p. 100 de chlorure de sodium, est amené à 6’4 (point iso-élec- 
trique du virus), et 5 p. 100 de PEG 20000 sont ajoutés et dissous. 
La préparation est maintenue 1 h à 4 OC, puis centrifugée 15 min à 16 O00 g et 
le surnageant est élimine. Les culots sont remis en suspension dans le tampon de 
broyage, dilué dix fois (dans environ 1/10e du volume initial). Après une centri- 
fugation de 12 min à 10000 g, cette suspension est ultracentrifugée pendant 2 h 
à 78 O00 g. Les culots sont dispersés dans 2 ml de tampon borate de potassium 0,05 M, 
pH 8,2, et laissés en repos 1 h. 
Après une centrifugation de 10 min à 10 O00 g, les 2 ml de suspension sont mélangés 
à 2 ml d’une solution à 80 g/100 ml de chlorure de cesium dans un tube de rctor 
SW 50. 
Après 14 h à 115 O00 g, une bande opalescente de virus purifié est visible dans 
le  tiers inférieur du tube. Cette bande est collectée à la pipette et le virus est reconcen- 
tré par ultra-centrifugation, après dilution ou dialyse. 
Le spectre d’absorption en UV du virus purifié montre un maximum à 267 nm 
et un minimum à 250 nm. Le rapport DO,,/DO,, est de 1,09 ; et le rapport 
D0,,7/D0,6,, est de 1,08. Ces valeurs sont caractéristiques du Virus du Clump de 
l’Arachide. 
Le rendement est de l’ordre de 15 à 20 mg/kg de feuilles. 
L’inoculation d’une série de dilutions de la suspension de virus purifié à des 
C. amoranficolor et à des arachides montre que celui-ci est aussi infectieux que le  
virus préparé par la méthode au .butanol-chloroforme. Une suspension contenant 
0,02 mg/ml de virus purifié est infectieuse jusqu’à une dilution de 
Conclusion 
La détermination du point ¡so-électrique du Virus du Clump de l’Arachide, 
qui s’est révélé très proche de la neutralité (pHi = 6,45), permet de comprendre les 
difficultés rencontrées lors des premiers essais de purification (Thouvenel et al., 1976). 
Les tampons de broyage utilisés avaient un pH de 8 que le  broyage du matériel 
abaissait et amenait près du point ¡so-électrique du virus. Comme le virus précipite 
dès qu’il est placé à un pH proche de son point iso-électrique, les centrifugations 
à faible vitesse (environ 5 O00 g) avaient entraîné sa sédimentation. 
Nous n’avons pas pris en compte, dans I’étude de la stabilité du virus en fonction 
du pH, les différences de forces ioniques entraînées par la variété des tampons uti- 
lisés ; il est cependant probable que celles-ci seraient à considérer pour une étude 
plus précise. Toutefois, cette première approche, jointe à la connaissance du point 
¡so-électrique, a permis d’utiliser I’acidification comme méthode de clarification. 
Porter l’extrait à pH  4,2 pendant un temps court (30 min) ne produit qu’une perte 
98 J.-C. THOUVENEL, C. FAUQUET, M. DOLLET 
négligeable de virus, mais suffit à dénaturer les protéines de la plante. Le pH doit 
alors être remonté au-dessus de 8 avant d’éliminer les protéines dénaturées car, 
à ce pH, le  virus ne sédimente pas lors d’une centrifugation à basse vitesse. Par 
contre, lors de la précipitation par le PEG, il est intéressant d’amener le pH aux 
environs du point ¡so-électrique, ce qui permet de précipiter tout le virus en très peu 
de temps. Cette méthode de purification donne de meilleurs rendements (15 à 20 mg/kg 
de feuilles) que la méthode au butanol-chloroforme ; le virus est aussi infectieux, 
et elle est réalisable en moins de 24 h avec un minimum d’opérations. 
Les phénomènes d’agrégation constituent une des difficultés majeures dans la 
purification de certains virus en bâtonnet à plusieurs composants déjà décrits comme 
le c Nicotiana Velutina Mosaic Virus )) (Randles ef al., 1976) et le c Beet Necrotic 
Yellow Vein Virus )) (Tamada et Baba, 1973 ; Putz, 1977). Dans ce dernier cas, le 
virus n’est pas sédimenté par 15 min à 5 O00 g si le  pH  est supérieur ou égal à 7. En 
dessous de pH 7, le  virus se retrouve en partie dans le culot, et à pH 5 tout le virus 
est sédimenté. II est d’autre part bien établi que la force ionique et le pH sont déter- 
minants sur I’état d’agrégation de la protéine native des virus en bâtonnet :omme le 
Virus de la Mosaïque du Tabac, le Virus du Rattle du Tabac, et le Barley Stripe Mosaic 
Virus (Fritsch ef al., 1973 ; Atabekov et al., 1968 ; Hirth, 1976). II serait intéressant 
de rechercher s i  les phénomènes d’agrégation, observés lors des purifications des 
virus en bâtonnet à plusieurs composants, ne sont pas dus aux pH utilisés, si, comme 
nous l’avons montré pour le  Virus du Clump de l’Arachide, le pHi est proche de la 
neutralité. 
R e p  pour publicafion en février 1978. 
Remerciements 
Les auteurs remercient leur directeur scientifique, le Professeur L. Hirth, pour ses conseils dans Ia 
réalisation de ce travail, et pour la correction du manuscrit. 
Summary 
Effect of pH on Peanuf Clump Virus, 
and a rapid method of purificafion 
The ¡so-electric point of Peanut Clump Virus (PCV) is determined. Stability of PCV at different pH 
values i s  studied by variation of infectivity. According to these results, a new rapid method of purifica- 
tion i s  described, using clarification by acidification. 
RéMrences bibliographiques 
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Influence du pH sur le Virus du Clump de l'Arachide (Peanut clump virus) et nouvelle méthode rapide de purification

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