Brenière, Simone Frédérique

Carlier, Y.

Echalar, L.

Tibayrenc, Michel

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Données isoenzymatiques pour onze souches boliviennes de Trypanosoma cruzi : interprétation génétique et calcul de distances

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Données isoenzymatiques pour onze souches boliviennes de Trypanosoma cruzi. 
Interprétation génétique et calcul de distances (‘1 
Michel TIBAPRENC* 
Frédérique BRENIERE** 
Lourdes ECHALAR** 
Yves CARLIER*** 
Résumé 
Les azttews dhivem! le @ofil isoempm%p~e de 11 SO~&I~S bohit?m%es de Trypanosoma crnzi POU~ 10 eFtZy?FWS, 
@Y rapport à des cultures stmdavd de Y&yewe. Ils tentent zwe htevpvétatioîz gthétique de ces zymogrmwles, et j~opose~~t 
m #wticr calcul de distance génétiqzie $~ow 3 somhes. 
Mots-clés : Tr_ypanosomn crztzi -Bolivie - Zymogrammes - Interprétation génétique. 
Summary 
ENZYMATIC DATA FOR ELEVEN BOLIVIAN STRAINS OF TRYPANOSOMA CRUZI. GENETIC INTERPRETATION AND ESTIMA- 
TION OF GENETIC DISTANCE 
Thc aztthors describe emymatic type of 11 bolivian straim of Trypanosoma crnzi foy 10 txzytF8es with yegnvd to 
refweme stmdnyd cultrwes. TJfey try to give a geneti c i&ev;fyetatiw?t of tJLese zymognms, mtd pyo$ose a jirst estimation 
of genetic dislame foy 3 styai,ns. . . _ 
Key words : T~yjazoson~a crz~i - Bolivia - Zymograms - Genetic interpretation. 
L’approche génétique des zymogrammes de 
flagellés (Tibayrenc, Cariou et Solignac, sous presse) 
permet non seulement de typer les souches, mais 
encore de les comparer entre elles, d’élucider leurs 
liens de parenté. Dans cet article, nous donnons les 
premiers résultats expérimentaux pour il souches 
boliviennes de Tyypa?tosowla cnk isolees a partir de 
triatomes récoltés en des points variés du territoire 
bolivien. 
MATÉRIEL ET MÉTHODES 
Prélèvement et culture des trypanosomes 
Après examen des triatomes (tous appartenant 
à l’espèce majoritaire en Bolivie : Triatoma ittfestatts) 
pour sélectionner les sujets infestés, on a procédé au 
prélèvement des souches comme suit : dissection du 
(1) Travail réalise avec l’aide de la Coopération Technique Française (Ministère des Affaires Étrangères) et l’aide de 
la j3élé~ation Générale à la Recherche Scientifique et Technique : no d’aide DIF/TVD/79 no 70486. 
* Eutowologiste médical ORSTOM. 
** Assistantes de recherche I.B.B.A. 
*** Go-divectew I.B.B.A.. 
Ahfesse actitelle : 
Bolivia. 
Imtituto Bolivkî-to de Biologin de Altwn (I,B.BA.), Embajada de Framia, Ca~illa 824, La Paz, 
Cal~. O,R,S.T.O.iW., sév. Ext. m!d, et Pwasitol., vol. XIX, no 2, 1981 : 129-134 129 
M. TIBAYRENC, F. BRENIERE, L. ECHALAR, Y. CARLIER 
tube digestif complet à l’aide d’instruments stériles, 
ensemencement en tube de milieu GLSH. Les cultures 
ont été repiquées selon un rythme dépendant de leur 
cinétique. Quand la multiplication a été satisfaisante, 
on les a passées en flacons contenant 40 ml de milieu, 
puis 200 ml, puis 1 1. Chaque souche a d’autre part 
été passée sur souris par injection intrapéritonéale 
de culture, ou de broyat de tube digestif de triatome 
infecté. Quand la parasitémie a été suffisante (1 mois 
environ), on a repiqué en milieu GLSH en prélevant 
le sang de la souris par ponction intracardiaque. En 
vue des électrophorèses, les trypanosomes ont été 
récoltés par triple centrifugation de 10 minutes à 
3 000 G. et double lavaae au liauide de Hans Wallace. 
Le culot obtenu a été addition& d’une quantité egale 
de liquide hypotonique stabilisateur d’enzyme (dithio- 
treitol 0,2M, acide E aminocaproïque 0,2M, EDTA 
0,2M) et laissé sur un lit de glace pendant 20 minutes. 
L’extrait obtenu a été réparti en doses de 15 micro- 
litres, refroidi instantanément par immersion dans 
l’azote liquide, et stocké à -700. 
Provenance des souches 
Elle est donnée par le tableau 1. 
TABLEAU 1 
Provenance des souches étudiées 
Désignation Nom de lieu Région Altitude Type de gîte 
1 Bario lindo Camiri, 300 km 400 m Domiciliaire 
sud de Santa Cruz 
2 Gararapo - - Péridomicil. 
3 Lagunilla - - Domiciliaire 
4 Tachiperenda - - - 
5 Sallani Sapahaqui, 60 km 2 600 m Péridomicil. 
sud de La Paz 
6 Pabellon 1 - - - 
7 Pabellon 2 - - - 
8 Pabellon 3 - - - 
9 Pabellon 4 - - - 
10 Pabellon 5 - - - 
11 Trinidad Pampa Coripata, 120 km 1 700 m - 
est de La Paz 
A = LeisJw?awia brasiliensis brasiliewis provenant de l’Institut Prince Léopold d’Anvers. 
B = Trypanosoma ralzgeli de l’Institut Pasteur de Lille. 
C = T,ry$anoso.tna crzc.zi de l’Institut Pasteur de Lille. 
130 CnA. O,R.S.T.O.M., sh. Ed. nzéd. et Pwasitol., vol. XIX, no 2, 19Sl : 129-134 
Méthode électrophorétique employée 
On a utilisé comme support l’acetate de cellulose 
(matériel HELENA). Chaque plaque peut porter 
8 échantillons différents, et le bac contient 3 plaques. 
Les 10 enzymes employées ici (phosphoglucomutase, 
malate déshydrogénase NAD dépendante, malate 
déshydrogénase NADP dépendante ou « malic en- 
zyme )I, isocitrate déshydrogénase, glutamate dés- 
hydrogénase NAD dépendante, glutamate déshydro- 
génase NADP dépendante, lactate deshydrogénase, 
glucose 6 phosphate déshydrogénase, 6 phospho- 
gluconate déshydrogénase, phosphoglucose isomérase) 
peuvent être révélées avec 10 à 15 microlitres de 
l’extrait de trypanosome (le produit d’un seul tube 
de culture). Ceci est précieux pour les laboratoires qui 
ne sont pas équipés pour les cultures massives. Les 
migrations prennent 10 à 15 minutes. La revélation 
des plaques se fait en 30 minutes au plus. Les echan- 
tillons se conservent à sec dans un classeur. Pour les 
enzymes PGM, GGPD, 6PGD et PGI, on a utilisé 
sans les modifier les techniques préconisées par Kreut- 
zer et Christensen (1980). Pour MDH et ME, la solution 
de révelation a été modifiée (tampon tris malique 
concentre : Tris : 1,5 g ; acide malique : 10 g ; eau 
distillée : 250 ml, ajustement du ph à 7). Les 2 GDH 
ont fait appel à un tampon tris glutamique ainsi 
composé : Tris : 1,5 g ; acide glutamique : 15 g ; eau 
distillée : 250 ml ; ajuster le ph à 7. Pour ces 2 enzymes, 
le tampon de migration utilisé a été le no III de Shaw 
et Prasad (1970). LDH a été révélée en modifiant 
le kit commercialisé par HELENA (2 flacons dilues 
chacun dans 1,5 ml d’eau distillée, mélangés à 5 ml 
d’agarose à 2 ‘;/o chauffé à 500). Le tampon de migra- 
tion utilisé a été celui que commercialise HELENA 
(HR dilué à 1 750 ml d’eau distillée). IDH a été 
adaptée de Shaw et Prasad (1970) avec leur tampon 
de migration no XIV. 
RÉSULTATS 
Certaines enzymes apparaissent monomorphes, 
d’autres sont variables. C’est cette variabilité qui 
nous a permis de formuler des hypothèses sur la 
commande génétique des isoenzymes de trypanosomes. 
- PGM : la souche de référence C (Lille) montre une 
bande unique, migrant à 25 mm de l’origine. Les 
‘souches boliviennes 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11 montrent 
le meme type que C. Les souches 4 et 5 ont une double 
bande (migration 24 et 23 mm de l’origine) (photo 1). 
Ces 2 types rappellent ceux qu’expose Godfrey (1979). 
La souche de référence B (T~~y/~n~zosowta rnngeli) 
montre une bande unique à 31. La souche de référence 
A (Leishxakz ~ra.sili~&s bvnsilimsis) donne une 
PHOTO 1, - Zymogramme de T~y@nosoma pour l’en- 
zyme phosphoglucomutase (en négatif). De gauche 
à droite : Trypa+zosoma rangeli, T. wzi+ Institut 
Pasteur de Lille (souche C), souches boliviennes 
T. wztzi nos 10, 5, 4, 1, 5 et 2. 
DONNÉES ISOENZYMATIQUES POUR ONZE SOUCHES BOLIVIENNES DE TRI’PANOSOMA CRUZI 
bande à 33. L’intensité des bandes est assez uniforme 
d’un échantillon à l’autre. Les doubles bandes sont 
plus ténues que les simples. La révélation est satis- 
faisante en une demi-heure. 
- MDH : C a 2 bandes éloignées l’une de l’autre 
(13 et 5). Toutes les souches boliviennes répondent 
à ce type, sauf 10 qui ne s’est pas révélée. B (T. Y~H- 
gel;) a une seule bande à 10 mm. A n’a pas été testée. 
- ME : l’aspect rappelle celui de la MDH. C a 2 
bandes (34 et 19 mm). 1, 2, 3, 6, 8, 9, 11 montrent le 
même aspect. 4 et 5 ont la même bande rapide à 
34 mm, mais leur bande lente ne migre qu’à 16 mm. 
7 et 10 n’ont pu être testées. B a une seule bande, 
toujours très intense et de révélation rapide, à 16 mm. 
A montre une bande à 30 mm. 
- IDH : la révélation de cette enzyme est capricieuse. 
De plus, la vitesse de révélation diffère d’une souche 
à l’autre, ce qui oblige à diluer les souches dont l’acti- 
vité enzymatique est la plus forte (C surtout). C a 
2 bandes très proches l’une de l’autre (23 et 21 mm). 
1, 2, 3 ont le même aspect. 4 et 6 n’ont que la bande 
23. 5 a une seule bande à 19 mm. 7 et B ne se sont pas 
révélées. 8, 9, 10, 11 et A n’ont pu être testeer. 
Cah, O.RS.T.O.M., sév. EM, méd. et Parasitol., vol. XIX, no 2, 1981 : 12(~-134 131 
PGM 
A B C 12 3 4 5 6 7 8 91011 
GDH NADP 
A B 6 7 
T 
10 11 
il 
MDH 
A 
LDH 
B Cl234567 8 9 10 11 C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 
cl2345678 
- 
? 
- 
9 - 
? 
- 
9 
- 
? 
- 
10 
- 
? 
- 
11 
Il ? ? 
Cl2345678 10 11 
GGPD 
A B B Ci23456 
IDH 
A 
6PGD 
GDH NAD PGI 
3 4 5 6 7 C 12 3 4 5 6 7 8 91011 
FIG. 1. - Diagrammes. 
h = Lsishstaiu. Ovnsiliensis bvasîliemis, Institut Prince-Léopolcl, Anvers. B = Tvypatzosomn vattgeli, Institut Pas- 
teur de Lille. C = T. cvztri, Institut Pasteur de Lille. 1 à 1.1 = souches boliviennes de T. crzrzi. 0 = enzyme non révélée. 
? = enzyme non testée. 
- GDH NAD : l’activité de cette enzyme est très Loti monomorphes : MDH rapide et lent, ME rapide 
faible. Il faut attendre au moins 112 h de revélation. GDH NADP, LDH, GGPD. 
L’interprétation des plaques est délicate et doit être Loti polymorphes : PGM, ME lent, IDH, GDH NAD, 
étayée par de nombreux essais comparatifs. C et 1 BPGD, PGI. 
montrent une double bande (16 et 13 mm) sur les Enzymes monomères : ce sont celles pour lesquelles 
plaques les plus nettes, une tache étalée sur d’autres. les hétérozygotes présumés ont 2 bandes : PGM, IDH 
2, 3, 4, 5, 6, 7 n’ont que la bande 16. 8, 9, 10, 1 i n’ont et GDH NAD. 
pu être essayées. B ne s’est pas révélée de façon inter- Enzymes dimères : celles pour lesquelles les hétéro- 
prétable. A montre une bande à 14. zygotes ont 3 bandes : 6PGD et PGI. 
- GDH NADP : au contraire, cette enzyme a une 
très forte activité. La révélation doit etre étroitement 
surveillée, l’intensite des bandes étant souvent suffi- 
sante au bout de 5 minutes. C et toutes les souches 
boliviennes ont une bande unique à il mm. B ne s’est 
pas révélée. A possède une bande à 15. 
Y- 
LDH : la révelation est très rapide pour T. cwzi 
moins de 5 minutes). C, 1, 2, 4, 5, 7 ont toutes la 
même bande, à 10 mm. Les autres souches boliviennes 
et A n’ont pas été testées. B a une double bande (19 
et 16 mm) d’intensité plus faible que la bande unique 
des T. crzbzz’, etde révélation plus lente (15 à 20 minutes). 
- GGPD : cette enzym.e n’a pu être essayée qu’une fois. 
C, 1, 2, 4 et 5 ont toutes la même bande, à 15 mm. 
Les autres souches boliviennes n’ont pu être essayées. 
B et A montrent une bande unique, migrant respec- 
tivement à 13 et à 21 mm. 
A titre d’exemples, les souches de T. crzczi montre- 
raient ici 3 allèles PGM, désignés 1, 2 et 3 par ordre 
de rapidité décroissante. Les souches C, 1, 2, 3, 6, 7, 
8, 9, 10, 11 seraient homozygotes l/l. Les souches 
4 et 5 seraient hétérozygotes 213. En ce qui concerne 
GPGD, il y aurait 2 allèles 1 et 2. Les souches C, 1, 2, 3, 
6, 7 et 9 seraient homozygotes 212. Les souches 4 et 5 
TABLEAU II 
Calcul des distances génétiques 
pour les souches C, 1, 4 et 5 ; fréquence des allèles 
- ÜPGD : C, 1,2,3, 6, 7 et 9 ont une bande à 16 mm. 
4 et 5 sont tri-bandes (16, IX et 20 mm). L’intensité 
de ces 3 bandes est symétrique (2 bandes extrêm.es 
également intenses, et plus ténues que la bande 
médiane), S, 10 et il n’ont pu être testées. B et A ont 
une simple bande (respectivement à 23 et 25 mm). 
- PG1 : cette enzyme n’a pu être testée qu’une fois. 
C, 1, 7 et B ont une bande simple à 14 mm. 4 et 5 ont 
3 bandes (14, 17 et 21), avec le meme aspect symétrique 
que pour GPGD. Les autres souches boliviennes n’ont 
pu être testées. A n’a qu’une bande (19 mm). Pour 
les T. CVUZ~, les types rappellent ceux que Chance 
et al. (1978) ont observé chez des Leislma~~sia pour 
cette enzyme. Toutes les enzymes, à l’exception de 
GGPD et de PGI, ont été essayées plusieurs fois : les 
zymogrammes ne se sont pas modifiés. 
DISCUSSION 
L’hypothèse que nous avons proposee par ailleurs 
(Tibayrenc, Cariou et Solignac, sous presse) : structure 
diploïde des trypanosomes, permet d’interpréter nos 
zymogrammes de T. crmi comme suit : 
2 loti de commande : MDN et ME. 
1 seul locus : les autres enzymes. 
Locus Allèle C 1 4 5 
PGM...... 1 1 1 0 0 
2 0 0 0,5 0,5 
3 0 0 9,5 625 
MDH 1. . . 1 1 1 1 
MDH 2... 1 1 1 l 
ME l..... 1 1 1 1 
ME 2..... 1 1 
2 0 0 
0 0 
1 l 
IDH.. . . . . 1 
2 ::5 
0,; 
i 0 
3 0 0’ 0 1 
GDH nad.. 1 0,5 0,5 1 1 
2 0,5 0,5 0 0 
GDH nadp. 1 1 1 1 
LDH.. . . . . 1 1 1 1 
GGPD..... 1 1 1 1 
GPGD..... 1 0 025 
2 1 1 995 0:: 
PGI.. . . . . . 1 0 9,5 
2 1 : 6,5 ::5 
DONNÉES ISOENZYMATIQUES POUR ONZE SOUCHES BOLIVIENNES DE TR YPANOSOMA CR UZI 
Ca/r. O.R.S.T.O.M., sév. Ed. .&d. et Pavasitol., vol. XIX, no 2, 1981 : 129-134 133 
M. TIBAYRENC, F. BRENIERE, L. ECHALAR, Y. CARLIER 
seraient hétérozygotes 112, leur bande intermédiaire 
étant due à l’action d’une molécule enzymatique 
hybride (enzyme dimere) . 
Subjectivement, l’examen des plaques suggère que 
les souches 4 et 5 sont «très » différentes des autres 
souches boliviennes, lesquelles paraissent proches de 
la culture de Lille (C), ou semblables à elle. Le calcul 
des distances génétiques (Nei, 1972 ; Tibayrenc, 1980) 
va nous permettre de quantifier ces liens de parenté. 
Malheureusement, les données ne sont complètes que 
pour C, 1, 4 et 5. Le détail des calculs est exposé dans 
le tableau II. Rappelons que les calculs doivent inclure 
tous les loti étudiés, y compris les monomorphes. 
La fréquence des allèles est soit 0, soit 0,5 (souches 
hétérozygotesj soit 1. On obtient les résultats suivants : 
Distance génétique standard (Ds) entre C et 1 = 0 
(souches en tous points identiques). 
DsC-4 : 0,3O. 
DsC-5 : 0,36. 
D~l-5 : 0,lO. 
Rappelons la signification concrète de la distance 
genétique entre 2 populations : nombre moyen de 
codons différents /gène. 
Les distances observées sont de l’ordre de celles 
qu’on rencontre (dans certains cas) chez des insectes 
entre 2 espèces très apparentées. Mais il est extrême- 
ment hasardeux de chercher à établir des standards 
de distances qui correspondraient à tel ou tel niveau 
taxonomique. Même au sein d’un même genre (Droso- 
fdila par exemple), on observe de grandes disparités. 
En ce qui concerne les trypanosomes cependant, la 
distance génétique traduit la même chose que pour 
les autres animaux : une parenté génique, dont la 
signification biologique sera appréciée par des travaux 
ultérieurs. 
Nous n’avons pas tenté d’interprétation génétique 
pour Leislwrnnia brasiliemis lwasiliemis et Try$nlto- 
So?j!a rang&, nos donnees étant insuffisantes. Notons 
toutefois que Leishmfwia n’a montré aucun allèle 
commun avec les T. wwi, et que T. rmgeli n’en 
aurait que 2 (ME lente avec les souches 4 et 5, GGPD 
avec l’alléle lent des T. wuzi). 
CONCLIJSION 
Les souches boliviennes confirment la variabilité 
« intraspécifique 1) déjà notée pour T. cn~zi par d’autres 
auteurs (Miles et al., 1977). L’analyse génétique des 
zymogrammes peut permettre de quantifier les liens 
de parenté existant entre les différentes « souches I), 
et de reconsidérer certains points obscurs (taxonomie, 
existence d’une sexualité). 
Mamtscvit rep au Service des Édith~s de L’ORSTOM, 
le 10 t>IaYs 1981 
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