Bories, Christian

Gantier, Jean Charles,

Gueyouche, Chantal

Horizon / Pleins textes

Pouvoir infectieux des larves 
de Molinema desse tue 
(Nematoda : Filarioidea) obtenues 
chez un hôte intermédiaire inhabituel : 
Toxorhynchites amboinensis 
(Diptera : Culicidae) 
Christian B~RIES cl), Chantal GUEYOUCHE cl), 
Jean-Charles GANTIER cl), Philippe MORARD ('1, 
Romain VALIK QI, Philippe GAYRAL (l) 
RésuIr$ 
Molinema dessetae est une filaire de rongeur a microfilaires sanguicoles dont l’hôte a?finitif naturel est Procchrmys oris. 
Les microfîlaires séparées du sang par filtration SUT membrane sont injèctées à des Toxorhynchites amboinensis mâles et femelles. 
Elles se développent en larves infectantes en 21 jours. Trois P. oris sains ont étc infect& avec les larves infectantes. Deux sont 
devenus microfilarémiques 120 jours afirès et 1 ‘examen post mortem a mis en évidence des filaires mâles et femelles chez les trois 
animaux. Les larves L3 obtenues chez cet hôte intermkdiaire inhabituel sont réellement infectantes pour l’hôte dezinitrf 
m 
Mots-clés : Larves - Filaires - Microfilaires - Molinema dessetae - Toxorhynchitcs amboinensis. 
Summary 
DEVELOPMENT OF ?V~OLINEMA DESSETAE INFECTIVE LARVAE (NEMATODA : FILARIOIDEA) INTO AN UNUSUAL HOST : 
TOXORHYNCHITES AMBOINENSIS (DIPTERA : CULICIDAE). Molinema dessetae is a Rodent Filaria with blood circulating 
microfilaria, and the natural host is Proechimys oris. Microfilariae recozrered from blood 621 membrane filtration were inocu- 
lated into male and female Toxorhynchites amboinensis. They developped into third stage larvae as early as 21 days. 
Three Proechimys oris were injccted with these infective larvae. Trrro of them exhibit a microfilaremia after 120 days, and 
after autopsy a11 were infected by male and female filariae. L3 recovered from this unusual intermediate host are realb infeecfive. 
Key words : Larvae - Filariae - Microfïlariae - Molinema dessetae - Toxorhynchites amboinensis. 
Cah. ORSTOM, st% Ent. md. t’t ParmitoI., vol. XXIV, n" 3, 1986 : 207-212 
Dans l’entretien des cycles de fïlarioses, la pro- 
duction de lares infcctantes (L3) reste le facteur 
limitant à un usage extensif de ces modèles. En effet, 
à c&b de leur utilisation pour infecter des hôtes détï- 
nitifs. ces larves sont nécessaires pour des &Ides 
physiologiques et pharmacologiques in vitro, et pour 
la production d’antigénrs parasitaires. Le nombre de 
larves infectantes se développant chez un vecteur est 
n&essairement dcpendant du volume sanguin prélevé 
par l’arthropode et contr0lé par les mécanismes de 
limitation bien etablis chez les moustiques vecteurs 
de filaires (Bain. 1971 ; Petit et Spitalier-Kaveh. 
1978). Enfin les larves obtenues, considérées comme 
infectantes sur des critères morphologiques doivent 
être placées en situation de développement chez un 
hôte définitif adcquat afin de prouver la réalité de 
leur pouvoir infectant. Disposant d’un modèle de 
fïlariose in z~bw dont, en plus, les larves infectantes 
constituent une cible pharmacologique privilégiée, 
nous avons voulu étudier la production de ces larves 
chez un hC)te intermédiaire original : 7’oxw&chites 
nmhoi7wn.~ii (Doleschall, 1857). Molinema dc.ssctae (Bain, 
1973) est une filaire dc rongeur à microfïlaires (mf) 
sanguiroles ; l’hôte naturel est Proechimys oris 
Thomas, 1904 et le cycle en a été établi par Bain en 
1974. La standardisation de cet ensemble a permis 
de développer différents modèles pour Ëtudier les 
substances antifilariennes tant in zjiuo sur les P. oris 
filariens (Gavral rt tri., 1982) qu’in vitro sur les larves 
infectantes r&up&+es chez Ar&r n~@t;, le vecteur 
utilisb en laboratoire (Bories et al., 1986). T. nmboi- 
ncn,i.s présente l’avantage d’etre un gros moustique 
d’un tlevage relativement facile. II est utile comme 
multiplicateur de virus aprtns inoculation intrathoraci- 
que dans le diagnostic des arboviroses OU l’avantage 
de ne FIilS être hématophagc rPduit les risques de dis- 
s&rirlation (COZ ft a/., 1977). Ge travail a donc pour 
premier objectif l’obtention de larves infectantes de 
/zT. d~wr~tac. près inoculation traumatique des microfi- 
laires ; cnsuitc la virulence de ces larves sera contrô- 
lée par injrction c,hez Ic* t) ori.s, l’hôte défïnitif’ natu- 
rel et mTCySk iiprèS quatre 111015. 
1. iVat&iel et méthode 
L’hnte inwrm~diaire utilisé au laboratoire est 
AtA, acgppti, souche Gkep. Les conditions de cet ele- 
vage ont éte exposées préctdemment (Gayral et al., 
1982). Les A. a<~@ femelles s’infectent par piqûre 
sur P. ori.5 microfïlarCmiques. Les larves se dévelop- 
pent daims lc tissu adipeux de l’insecte. Les mues 1 et 
11 ont lieu respectivcrnent vers 7-8 et 13-14 jours. 
Les larves infectantes (L3) sont récupérées par dissec- 
tion des A. uqypti aux l9e cm 206 jours. Les rongeurs 
utilisés sont des P. oris descendant de la souche origi- 
nale antérieurernent décrite (Gantier et Gayral, 
1979). Lorsque leur âge est d’environ six semaines, 
ils sont infectés par in.jection sous-cutanée de 200 lar- 
ves infectantes. L,es premitres microtïlaires apparais- 
sent dans le san,g périphlriyue 80 à 90 jours plus 
tard. 
1.2. L'HOTE INTERMÉDIAIRE hRTIF1CIE.L : T. rlA1BONlEhW.S 
La souche provient du service d’Entomologie 
médicale de 1’ORSTOM à Bondy. L’élevage de ce 
moustique se fait selon la technique utilisée dans ce 
laboratoire (Coz et Dbsenfant, communication per- 
sonnelle). L’insectarium est réglé à 80 % d’humidité 
relative, à une température de 27 f 1’ C, avec une 
photopériode de 12 heures. Les femelles pondent à la 
surface de l’eau contenue dans des récipients noirs. 
Le niveau de l’eau affleure le bord supérieur du réci- 
pient pour évitrr la noyade de l’image. Les œufs 
embryonnés blancs. hydrofuges, flottent à la surface. 
Un jour sur deux, l’eau des pondoirs est vidée dans 
UII petit bac à fond blanc lais& dans l’insectarium. 
Les larves apparaissent en 45 à 48 heures ; elles sont 
placées individuellement dans des pots de plastique 
(diamètre : 3 cm, hauteur : 5 cm) remplis avec 
10 ml d’eau du robinet préalablement équilibrée à la 
temperature de l’insectarium. Ces larves carnivores 
sont nourries à satibté avec des larves stade 1 ou 2 
d’dedes aeg@ti. La nymphose se produit environ 26 à 
28 jours aprés. Les nymphes sont récupérées, réunies 
par 15 à 20 dans un récipient rempli aux deux tiers 
d’eau du robinet propre placé à l’intbrieur d’une 
cage en tulle (0,50 x 0,,35 x 0,35 m). L’émergence 
des imagos a lieu quatre à six jours plus tard. Les 
adultes mâles et femelles se nourrissent d’eau gluco- 
sée à 20 % et d’une tranche de fruit frais, pomme 
ou orange. Un pondoir est introduit dans la cage 
cinq jours après la formation du premier couple. 
Lors des expériences nous utilisons des T. amboinensis 
de même génération et même taille avec un nombre 
égal de mâles et de femelles. 
1.3. PRODUC:TION DES LARVES INFEGTANTES C;HEZ T. 
A AIBOIXE NSIS 
1,3.1. Isolrmcnt et ,tkparation des micr@aires 
Les mf sont séparées du sang par une technique 
de filtration sur membrane. Le sang est prélevé par 
Dévelop/wment dt~ M. dessetae chtz T. amboinensis 209 
ponction sinusale chez le rongeur. L’anticoagulant 
utilisé est une solution de citrate de sodium à 3,6 %. 
Le pr&Avement est ensuite dilué dix fois avec du 
RPMI 1640 tamponne par 25 mmol d’Hepes par 
litre (GIBCO) et filtré sur une membrane en poly- 
carbonate de porosité 5 kbrn, diamètre 13 mm 
(Nucléopore) à l’aide d’un appareil Swinnex QlO 
(Millipore). Les microfïlaires retenues sur le filtre 
sont remises en suspension dans 100 ~1 du milieu de 
dilution. Cette méthode concentre environ quatre fois 
les microfilaires. 
1.3.2. Inoculation des T. amboinensis 
Les aiguilles d’injection sont préalablement pré- 
parées à partir de tube à hématrocite en verre 
(Hyland, 0.35” id. x 3.55”) selon la technique de 
,Coz et al. (1977). L es adultes immobilisés par un 
séjour à + 4% pendant dix minutes, sont mainte- 
nus au froid lors de l’inoculation sur une boîte de 
Petri contenant de la saumure congelée. L’insecte 
étant maintenu sur le dos, l’injection est faite en 
introduisant l’aiguille sous la membrane au niveau 
du cou (Coz et al., 1977). Un volume de 0,6 ~1 est 
pousse par de l’air comprimé et injecté (,Rosen et 
Gubler, 1974). Remis dans l’insectarium, les insectes 
ayant bien résisté à cette inoculation se remettent sur 
pattes et volent dans l’heure qui suit, Par convention 
le jour de l’inoculation est appelé Jl. 
1.3.3. Récu@ration des larves et inoculation au Proechi- 
mys oris 
Les T. ambioncnsis sont disséqués individuelle- 
ment en dénombrant les larves obtenues dans la tête, 
le thorax et l’abdomen. Ensuite, celles-ci sont regrou- 
pées et injectées à de jeunes P. oris selon le protocole 
habituel. Le contrôle de l’infection est fait par la 
recherche des mf dans le sang circulant et des filaires 
adultes dans la cavité péritonbale lors de l’autopsie 
pratiquée 120 jours après l’inoculation (Gayral et al., 
1982). 
2. Résultats 
Les T. amboinensis au nombre de 68 ont été ino- 
culés en deux lots à trois jours d’intervalle (expé- 
rience no 1 : n = 32, expérience no 2 : n = 36). 
Les mf proviennent de P. oris différents pour chaque 
expérience. Le nombre de mf injectées est estimé en 
les comptant dans 0,6 ~1 mesuré avec l’aiguille 
d’injection puis déposé sur une lame. Ce nombre est 
86 5 44 (déviation standard) lors de la première 
expérience (huit mesures) et de 134 * 78 (six mesu- 
r-es) lors de la deuxième. La mortalité des T. amboi- 
nensis a été de 62 % dans la première expérience et 
de 61 70 dans la deuxième. Les dates de dissection 
des moustiques survivants ont été choisies en fonc- 
tion d’expériences préliminaires (tabl. 1). Dans le 
premier lot, les moustiques sont numérotés de 1 à 
12 ; un mâle et une femelle ont été disséqués respec- 
tivement à *J20 et 521, le reste à 522. Le deuxième 
lot, no 13 à no 26, a été disséqué à 524. Les larves 
infectantes récupérées ont bté injectées à trois jeunes 
P. oris. Le rongeur 1955 B a été infecté en deux 
temps avec les larves infectantes récupérées chez les 
T. amboinensi.r 1 et 2. Les L3 récupérées à 522 chez 
les moustiques 3 à 12, et à 524 chez les moustiques 
13 à 24 ont été respectivement injectées à 1958 B et 
1959 B. 
Les résultats de la dissection individuelle des 
insectes sont portés dans le tableau 1. Le tableau II 
montre la durée du développement des stades larvai- 
res de Molinema dcssetae chez T. amboinensis. Le sex- 
ratio des survivants (tnâles/femelles) dans les expé- 
riences no 1 et no 2 est respectivement de 1,4 et de 
1,33. La répartition des larves infectantes dans le 
corps des insectes est detaillée par sexe et par date de 
dissection dans le tableau III. 
Les résultats des autopsies des P. oris infectés 
sont présentés dans le tableau IV ; les trois rongeurs 
inoculés sont effectivement parasités par des filaires 
de l’un et l’autre sexe. 
3. Discussion 
Les résultats dtmontrent que, à travers T. amboi- 
nensis, il est possible d’obtenir des L3 de M. dessetae 
réellement infectantes. Le développement chez P. oris 
est normal avec obtention d’adultes et ponte de mf 
par les femelles. Le développement des mf injectées 
est complet et à peine allongé par rapport aux 
19-20 jours nécessaires chez des femelles d’A. aeg,@tz’ 
infectées par voie naturelle et élevées dans les mêmes 
conditions d’environnement (Gayral ft al., 1982). Il 
devrait être possible de raccourcir ce délai en modi- 
fiant le régime alimentaire des T. amboinensis adultes 
par un apport protidique palliant l’absence de repas 
sanguin. Ce temps est pourtant plus court que celui 
obtenu chez Anopheles stephensi : 27 jours à 25’C 
(Bain, 1974). Le rendement des inoculations L3 
récupérées/mf injectées est de 21 % dans la Premiere 
expérience et de 6 % dans la deuxième. Une dissec- 
tion tardive (J26) au cours de la dernière expérience 
pourrait être la cause de cette différence de pourcen- 
tage, les L3 étant infectantes des 521 (tabl. IV). 
207-2 12 
310 Ç. Bories, C. Gueyouchc, J.-C,‘. Gantier et al. 
RSpartiticJn des larves infectantes de .lfcrlinema dm&r. E.P. : Essai préliminaire 
Nombre des 
1. amboinensls 
(PI ou F) 
E.P. M 
E.P. M 
E.P. F 
E.P. N 
1 14 
2 F 
3 F 
4 El 
5 F 
b M 
7 t.1 
8 F 
Y M 
10 F 
11 n 
12 M 
Moyenne ler Exp. 
n = 10 
13 M 
14 El 
15 F 
10 11 
17 F 
18 F 
19 1.1 
2u M 
21 F 
Moyenne 2e Exp. 
n E 14 
Date de la 
dissection 
J 17 
J 1s 
J 21 
J 21 
J 21 
J 22 
J 24 
J 24 
J 24 
J 24 
J 24 
J 24 
J 24 
J 24 
J 24 
J 24 
J 24 
J 26 
J 2u 
J 26 
3 20 
J 20 
J 26 
J 26 
J 26 
J 26 
J 2b 
J 2b 
J 20 
J 2b 
J 26 
J 26 
- 
Stade et nombre de larves 
Tête 
1Lê 
0 
LL3 
lL3 
lL3 
lL3 
IL3 
IL3 
(3 
2L3 
2L3 
13L3 
5L3 
0 
3L3 
lL3 
2,s 
0 
4L3 
0 
3L3 
0 
0 
0 
0 
2L 
3 
0 
0 
3L3 
6L 
3 
5L3 
l,h4 
4L2 
0 
IL3flL2 
" 
4L3+1L2 
.1L3ClL2 
7L3 
2L3 
5L3 
7L3 
5L3+1L2 
10L3 
IL3 
0 
14L) 
2L3 
0 
SL2 
4L3 
0 
8L3+lL2 
4L3 
4L 
3 
WL3 
22L3+2L* 
WL3 
IL3 
2L3 
13L3+1L2 
0 
20L3 
lL3 
SL 
2 
SL2 
15L3+1L2 
lL3 
13L3+2L2 
ZZL3+1L2 
12L3 
1LL3 
!7L3+3L2 
19L3 
a L3 
25L3 
19L3+lL2 
0 
i 
0 
6L3 
4L3 
3L3 
0 
0 
0 
2L3 
IL3 
0 
0 
0 
9L3 
lL3 
0 
*L3 
3L3 
bL3 
0 
lL3 
0 
lL3 
3L3 
0 
il 
u 
8L3 
(2 
1,86 277 
37L3 
4L3 
15,7 
0 
lSL3 
7Lj 
12L3 
0 
lL3 
0 
jL3 
"Lj 
0 
0 
3L 
3 
231.3 
trL 
3 
IX, 2 
Diueloppement de M. dessetae chez T. amboinensis 
TABLEAU II 
211 
Stades larvaires de Molinrma dessetm présents chez T arnboinmsis. Entre parenthèses pourcentage relatif de L, et de LI 
Nombre de 
T. amboinensis 
disséqués 
Nombre total de 
larves présentes L2 3 
517 
518 
J21 
322 
J24 
5 5 (100%) 
8 8 (100%) 
31 3 (9,4-h) 
23 1 (4,3%) 
160 4 (2,w.l 
81 0 (0%) 
0 (0%) 
0 io7.) 
28 (90,6:;) 
22 (95,7%) 
162 (97,b%) 
81 (100%) 
TABLEAU III 
Repartition des larves infectantes de M&enu dessetar selon le sexe et la localisation anatomique 
Sexe et Nombre de 
T. mboineneie 
"infectnnta" 
Nombre de mf 
Date Tête Thorax Abdomen TOTAL 
injectées 
M n=6 84 524 2,33 5,17 8,33 16,33 
F n=3 84 524 4,67 7,33 9,33 21,33 
M n=5 134 326 2,6 4,@J 5900 11,60 
F n=5 134 526 2,00 1,20 1,40 4,60 
TABLEAU IV 
Résultat de l’inoculation des P. or& lors de l’autopsie effectuée à J120 
P. orls infectés 
Nombre de 
Numéro] Sexe 1 Qe L3 inject&s 
: 1: 5 U 1. 'r A T S 
Filaires adultes 8 J120 
I 
1955 B F 90 j 35 0 Un &Le, deux femelles 
1958 B N 30 j 162 12110 ul Quatre mCilcs, six femelles 
11959 BI El 1 45 j 1 81 1 5/10 ul Inuit mâles, cinq femelles 1 
I I I 
Le T. amboinensis no i 1 contenait 37 L3, mon- 
trant la possibilité d’obtenir des L3 en grande quan- 
tité. Trois moustiques mâles et deux femelles sont 
restés sans larves. Ceci peut être lié aux aléas d’une 
technique délicate et incomplètement possédée. Des 
études complémentaires sont donc nécessaires pour 
améliorer la technique d’inoculation et préciser le 
nombre optimal de mf à injecter. 
Les L3 obtenues sont infectantes pour l’hôte 
définitif. Des expériences de même nature réalisées 
avec B. malayi chez T. amboinensis n’avaient permis 
d’obtenir que des adultes mâles chez Meriones unguicu- 
Cuh. ORSTOM, s/r. Ent. md et ParmitoI., vol. X?XV, no 3, 1986 : 207-212 
212 
tutus (Cross et a/., 1980). Nos résultats confirment ce 
que l’on sait d$à sur la manque de spécificité parasi- 
taire des filaires vis-à-vis de leur hôte intermédiaire, 
et sur les avantages qu’un gros moustique non 
piqueur prbsente en matigre de production de L3 et 
d’absence de risques de dissémination accidentelle. 
L’utilisation de ce moustique avec les espèces de 
fïlaires pathogènes pour l’homme pourrait ainsi amé- 
liorer la production de larves et des antigènes fila- 
Cd’. Borins, 6’. G’ugyouche, J.-C,‘. Gantier et al. 
riens nécessaires pour un immunodiagnostic ou un 
futur vaccin, 
BIBLIOGRAPHIE 
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Pouvoir infectieux des larves de MOLINEMA DESSETAE (NEMATODA : FILARIOIDEA) obtenues chez un hôte intermédiaire inhabituel : TOXORHYNCHITES AMBOINENSIS (DIPTERA : CULICIDAE)

Pouvoir infectieux des larves de MOLINEMA DESSETAE (NEMATODA : FILARIOIDEA) obtenues chez un hôte intermédiaire inhabituel : TOXORHYNCHITES AMBOINENSIS (DIPTERA : CULICIDAE)

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