Digoutte, J.P.

Georges, A.J.

Germain, Max

Gonzalez, Jean-Paul

Hervé, Jean-Pierre

Huard, M.

Hème, G.

Robin, Y.

Saluzzo, J.F.

Horizon / Pleins textes

Ann. Virol. (Insì. Pasteur 
1983, 134 E, 221-232 
LE VIRUS BOZO (ArB 7343) : 
'UN NOUVEL ARBOVIRUS DU GROUPE BUNYAMWERA 
ISOLÉ E N  RÉPUBLIQUE CENTRAFRICAINE ; 
SA TRANSMISSION EXPÉRIMENTALE 
PAR AEDES AEGYPTI 
par J.-F. Saluzzo e) (*)y M. Germain e), M. Huard e), Y. Robin e), 
J.-P. Gonzalez e), J.-P. Hervé e)y A.-J. Georges e), G. Heme (3) 
et JPP. Digoutte (") 
e) Institut Pasteur, BP 923, Bangui (RCA), e) ORSTOM, BP 803, Bangui, et 
(3) Institut Pasteur, BP 220, Dakar (Sénégal) 
SUMMARY 
Bozo VIRUS (ArB7343): A NEW ARBOVIRUS 
OF THE BUNYAMWERA GROUP ISOLATED 
IN CENTRAL AFRICAN REPUBLIC; 
EXPERIMENTAL TRANSMISSION BY (( AEDES AEGYPTI )) 
Bozo virus (Arp 7343), a new arbovirus, was isolated in 1975 from a 
pool of 100 Aedes opok collected near the village of Bozo in a forest-gallery 
of semi-humid savannahs in the south of Central African Republic. Its 
group relation was established by complement fixation test within the 
Bunyamwera group; its distinktness from other Bunyamwera viruses was 
determined by neutralisation test. 
Culex pruina (2 strains) and Anopheles funestus (1 strain). 
Subsequently 55 strains were isolated from Aedes gr. africanus (52 strains) 
Transmission of Bozo in suckling mice by orally infected A. aegypti 
was demon'strated. 
Virological and serological studies in the Bozo region established the 
existence of a selvatic cycle for Bozo virus in which principally Aedes gr. 
crfricanus and monkevs occur. The support mechanism which maintains 
- - I -  ~ 
the  Bozo virus in the gallery-forests is discussed. 
Republic, Experimental transmission. 
KEY-WORDS: Bozo virus, Arbovirus, Aedes aegypti; Central African 
Manuscrit reçu le 28 octobre 1982, acceptéle 2 avril 1983. 
(*) Demandes' de tirés a part. 
o. R. S.T. O. M. Fonds Documentaire 
N " : a B 6 i k + ,  ~ ~-;,-" 
pJ -*". .. -". . . .'. Cote 
222 
INTRODUCTION 
Le  groupe Bunyamwera comprend 1s arbovirus dont la plupart on 
été isolés sur le continent américain. Quatre arbovirus de ce groupe ont 
été isolés en Afrique : Bunyamwera, Germiston, Ilesha e t  Birao, ainsi que 
le virus Shokwe non encore enregistré au catalogue des arbovirus. 
E n  1975, une souche virale ArB 7343 a été isolée en République Centr 
africaine d’un lot de 100 A e d e s  opok (Corbet e t  Van Someren) capturés dans 
le secteur-des savanes subsoudanaises, près du village de Bozo. Cette souche 
du groupe Bunyamwera a pu être facilement différenciée des autres virus 
de ce groupe au moyen de la réaction de séroneutralisation. 
Cinquante-cinq souches de ce même virus ont été, par la suite, isolées 
dans cette région ainsi que dans le secteur des savanes préforestières e t  en 
forêt. 
proposons le nom de Bozo. Les propriétés virologiques et  immunologiques, 
son aptitude à se multiplier e t  à être transmis par Aedes  (Sfegomyia) 
aeggpf i  sont clécrites. 
La distribution géographique e t  l’origine vectorielle des 56 souches 
isolées ainsi que les résultats d’une enquête sérologique parmi les popula-- 
tions humaines de la RCA nous permettent de présenter l’écologie de ce 
nouveau virus. 
Nous rapportons la description de ce nouvel arbovirus, pour lequel nou 
MATÉRIEL ET MÉTHODES 
1) Matériel entomologique. 
La quasi-totalité des moustiques ayant permis les isolements provient de 
galeries forestières situées à proximité des villages de Bozo (5010 N, 18030 E) et 
de Bouboui (4036 Ny 18019 E), appartenant respectivement aux secteurs sub- 
soudanais et préforestier (fig. 1). Les caractéristiques phytogéographiques et cli- 
matiques de ces régions ont été décrites de facon détaillée dans un précédent 
article [5]. En outre, une partie du matériel culicidien a été récoltée lors d’une 
mission à Lobé (3048 N, 17034 E), en zone forestière. 
Les moustiques sont capturés individuellement dans des tubes de verre qui 
sont ensuite bouchés avec un tampon de coton. Ils sont alors identifiés sur le vivant 
ou après anesthésie et regroupés en lots monospécifiques de 30 individus. Ils sont 
conservés sur le terrain à - 200 Cy puis stockés au laboratoire à - 700 C. 
2) Inoculations intrathoraciques a u  moustique d’élevage. 
La technique utilisée est celle de Rosen et Gubler [7] modifiée pa 
Une souche de A.  aegypti originaire de Bangui est utilisée à cet effet. 
adultes âgés de 48 h sont inoculés par injection intrathoracique. 
a été utilisée d’une part pour les tentatives d’isolement d’arbov 
FC = fixation d u  complément. 
11 
9' 
7. 
5' 
3: 
O 1w , 200 K m  
I I I 
I: Forët dense 
I l :  Savane preforestjere 
111: Savane sub-soudanaise 
IV: Savane soudanaise 
V : Pseudo- steppe 
\ 
'\  
Z A I R E  
Y 
-d -- 
I I I I l I I I I I l I 
I's. 17' 19' 21. 23' 25' 27' 
FIG. 1. - Carle des zones phgtogPograp1iiques de Ia Rdppnbliquc Cenfmfricaine. 
224 J,-F. SALUZZO ET COLL. 
broyats de moustiques et d’autre part, lors des expériences de multiplication et  
de transmission du virus. 
3) Multiplication et transmission expérimentale d u  virus par A. aegypti. 
La multiplication du virus Bozo chez A. aegypti a été réalisée avec le broyat 
initial de la souche ArB 14898 provenant d’un lot de A. africanus (Theo) selon l e ,  
protocole qui suit. Trois cents moustiques sont inoculés par voie thoracique puis 
maintenus en survie dans une cage ; ils se nourrissent sur un tampon d’ouate 
imbibé de saccharose et sont maintenus dans une humidité de 85 à 90 yo et à une 
température de 26OC 2. Des lots sont constitués à partir de la 248 heure et 
destinés au titrage sur souriceau. A cet effet, les lots sont broyés dans du liquide 
de Hanks albuminé (contenant des antibiotiques) afin d’obtenir une dilution de 
10-I. Des dilutions de 10 en 10 sont ensuite inoculées par voie cérébrale à des souri- 
ceaux âgés de 24-48 h pour la détermination du titre par la méthode de Reed et 
Muench [6]. 
La transmission du virus d’un souriceau virémique à un souriceau sain par 
A. aegypti a été réalisée avec la souche ArB 17251. L’infection naturelle de 
A. aegypti a été réalisée en plaçant ceux-ci dans des gobelets de verre recouverts de 
gaze. Des souriceaux virémiques sont maintenus sur la gaze. Au bout de 4 à 5 h, 
on procède à la séparation des femelles gorgées. Celles-ci sont placées dans une 
cage et mises à pondre avant d’être présentées à des souriceaux nouveau-nés pour 
essai de transmission. 
4) Méthodes d’isolement. 
Les tentatives d’isolement ont été réalisées par inoculation aux souriceaux de 
24 h. La technique de préparation des broyats et d’inoculation aux souriceaux es! 
celle décrite par Cornet et coll. [31. A partir de décembre 1978, les broyats qu1 
s’avéraient négatifs par inoculation directe aux souriceaux ont été traités selon 
la technique d’enrichissement sur A. aegypti. 
5) Méthodes d’idenfification. 
niques du laboratoire des Arbovirus de l’Institut Pasteur de Dakar. 
6) Méthodes sérologiques. 
La réaction d’inhibition de l’hémagglutination a été réalisée selon la méthode 
de Clarke et Casals [2]. 
La réaction de fixation du complément (FC) a été réalisée selon la méthode 
LBCF en microtechnique [l]. 
La réaction de séroneutralisation a été effectuée selon deux techniques. 1) Les 
sérums humains non dilués et inactivés ont été mis en présence de 50-100 DL,, 
de virus, pendant 1 h au bain-marie à 370 C avant l’inoculation de ces mélanges 
à une portée de 9 souriceaux. On a considéré comme positif tout sérum présentant 
un taux de protection d’au moins SO %. 2) Les sérums de singe non dilués et inac- 
tivés ont été m i s  en présence des dilutions de virus de raison 10. Après une incuba- 
tion de 1 h au bain-marie à 370 C, les mélanges ont été inoculés à des souriceaux. 
Le titre, établi par la méthode de Reed et Muench, a permis de déterminer l’indice._ 
de neutralisation. 
Ces réactions sérologiques ont été appliquées d’une part aux sérums humains * 
prélevés dans différentes zones phytogéographiques, d’autre part à des sérums de 
singes sentinelles Cercopithecus aethiops tantalus (Linné) placés dans les galeries 
forestières de la région de Bozo. Ces derniers ont fait l’objet d’un contrôle préalable, 
permettant de vérifier l’absence d’anticorps pour le virus Bozo. 
. 
La caractérisation et l’identification des souches ont été réalisées selon les tech- 
ARBOVIRUS BOZO ET AEDES AEGYPTI EN RCA 225 
RÉSULTATS 
1) Isolement et passages. 
La souche prototype du virus Bozo a été isolée à partir d’un lot de 
100 A .  opok (lot numéro ArB 7343), récolté le 19 novembre 1975 dans une 
galerie forestière de la région de Bozo. Le lo t  a été inoculé le 9 décembre 1975. 
L’isolement a été obteny à partir d’un souriceau malade prélevé le 
‘iè jour. La mortalité à l’isolement a été de 15 yo. Dès le premier passage, 
le temps d’incubation était de 2 jours avec une mortalité de 100 yo, comme 
pour les passages suivants. I1 n’a pas eté effectué de tentatives de réisole- 
ment de cette souche. 
2) Propriétés  phys iques)  et chimiques du virus. 
Les titrages et  épreuves de sensibilité ont été réalisés sur le 5è passage. 
Le virus Bozo filtre bien sur millipore de 200 nm (titre avant filtration 
7,6 log DL6,, t i tre après filtration 7’0 log DL,J. I1 est sensible au chloro- 
forme avec une baisse de 3,l  log DL,, après traitement. 
3) Pouvoir  pathogène expérimental .  
Le titre d’une préparation standard de virus Bozo par inoculation 
au souriceau de 24 h par voie cérébrale est de 7’6 log DL,,/0,02 ml avec 
un temps moyen de survie de 2 jours. I1 est pathogène pour les souris de 
21 jours inoculées par voie cérébrale (titre 5,5 log DL,,) et  non pathogène 
par voie péritonéale. 
4) Propriétés  immunologiques.  
La souche ArB 7343 ne produit pas d’antigène hémagglutinant les 
globules rouges d’oie après extraction par la méthode saccharose-acétone. 
E n  F C ,  le même antigène réagit avec les ascites immunes du groupe Bunyam- 
wem (tableau I). L a  réaction de séroneutralisation (tableaux II e t  III)  
permet de différencier le virus Bozo des autres virus du groupe Bunyam- 
wera. 
5) Autres  isolements du v irus  Bozo. 
Cinquante-cinq autres souches du virus Bozo ont été isolées (tableau IV). 
Elles proviennent de moustiques capturés dans trois zones pliytogéogra- 
phiques différentes : forêt (Lobé), savane préforestière (Bouboui) et  savane 
subsoudanaise (Bozo). Toutes les souches ont été obtenues à partir de 
Aedes  du groupe afr icanus ,  à l’exception de deux souches isolées de Culex  
p r u i n a  (Theo) e t  d’une souche isolée de Anopheles  funes tus  (Giles). Les 
observations virologiques dans la région de Bozo sont mentionnées sur 
la figure 2. 
La  quasi-totalité de ces souches a été obtenue par inoculation directe des 
226 
% 0 
E c h a n  I i l  10115. 
pos,  t i l s  
1 
II 
0-0- - * - - a  Pluviometrle mensuelle  Conversion serologique chl 
les singes sentinelles 
P l U V i O  
I- 1 -1- 
l 1 I I I 
- 
mm 
1 rie 
.o0 
O 0  
! O 0  
O 0  
O 
- 
FIG. 2. - Détection d u  virus Bozo dans les galeries foreslibres de la rdgion de Bozo par l'isolement des souches virales chez A. gr. africanus 
(colonnes noires = nombre de souches isolées pour mille moustiques) et/ou par la défection de conversions sérologiques chez les singes 
sentinelles. 

ARBOVIRUS BOZO ET AEDES AEGYPTI EN RCA 229 
tableau V. Les observations effectuées chez les 2 singes nous permettent 
de conclure qu’après une probable infection due au virus Bozo la persistance 
des anticorps fixant le complément est probablement de courte durée. La 
surinfection expérimentale obtenue par inoculation de 10 O00 DL,,/l ml 
par voie sous-cutanée au singe no 1 (tableau V) provoque dès le loè jour 
l’apparition d’anticorps inhibant l’hémagglutination de l’antigène Bunyam- 
wera. Au cours de cette expérience, des anticorps fixant le complément 
TABLEAU V. - Réponse immunitaire observée chez deux singes sentinelles 
placés dans la galerie forestière de Bozo 
après une probable infection par le virus Bozo. 
Singe no 1 Singe no 2 
Réponse 
après 
injection de 
RBac- Antigène 10 O00 DL,, 
tion ou virus 07/1979 06/1980 (07/19SO) 12/1980 04/1981 
IHA Bunyamwera O O 1/10 O O 
F C  Bozo O O 1/128 O 1/32 
Bunyamwera O O 1/128 NT NT 
Ilesha O O 1/256 NT NT 
Birao 0. O 1/64 NT NT 
S N  Bozo O 4.2 3,5 O 3,6 
Bunyamwera O 0;75 2;o 
Birao O 022 072 
Ilesha O 0,25 0,25 
NT NT 
NT NT 
NT NT 
IHA = inhibition de l’hémagglutination. 
FC = fixation du complément. 
S N  
NT = non testé. 
= séroneutralisation (résultat exprimé en log de l’indice de neutralisation). 
TABLEAU VI. - Résultats de l’enquête sérologique 
réalisée au moyen de la réaction de séroneutralisation 
pour le virus Bozo. 
Zone 
phytoghographique 
Région 
ou ville 
Nb 
de sérums testés 
% de 
serums 
positifs 
For& Basse Lobaye 80 non pygmées 15 
35 pygm6es 25 
Savane préforestière Bangassou 46 15 
Savane subsoudanaise Bozo 99 796 
Bambari 91 13 
Savane soudanaise Bouar 50 O 
Pseudo-steppe Birao 61 3 
Total 462 10,s 
J.-F. SALUZZO ET COLL. 
ont été décelés au 19è jour pour les différents antigènes testés du groupe 
Bunyamwera. La réaction de séroneutralisation après surinfection reste 
par contre spécifique. Ces observations nous ont fait retenir la réaction de 
séroneutralisation pour la réalisation d’enquêtes sérologiques visant à 
préciser l’incidence du virus Bozo. 
Enquêtes sérologiques chez l’homme. - Les résultats des enquêtes séro- 
logiques chez l’homme sont rapportés dans le tableau VI. Les sérums pfé- 
levés en Basse Lobaye (région de M’Baiki) proviennent de populations 
pygmées Aka et  des populations non pygmées appartenant à l’ethnie 
DISCUSSION 
L’isolement de nombreuses souches virales identiques entre elles, 
obtenu à partir de vecteurs différents capturés dans des zones phytogéo- 
graphiques variées, permet de conclure à l’authenticité de ce nouvel arbo- 
virus. Les relations antigéniques étudiées au moyen de la réaction de F C  
apparentent ce virus au groupe Bunyamwera. I1 peut être facilement diffé- 
rencié des autres virus de ce groupe au moyen de la réaction de séroneutra- 
L’isolement de plusieurs souches de virus Bozo dans les galeries fores- 
tières de la région de Bozo au cours des années 1979 e t  1980 e t  la mise en 
évidence, au cours de cette période, de conversions sérologiques chez les 
singes sentinelles permettent de conclure à l’existence d’un cycle selvatique 
faisant sans doute principalement intervenir les Aedes gr. africanus et les 
Les observations virologiques et  sérologiques effectuées dans la région 
de Bozo de 1975 à 1980 (fig. 2) montrent que le virus peut se manifester 
suivant au moins deux modalités distinctes : d’une part  sous forme de 
poussées à caractère épizootique très marqué (saison des pluies 1979 et 
1980), d’autre part par une circulation à (( bas bruit )) mise en évidence par 
l’isolement d’une souche en 1977 ( A .  africanus) et d’une souche en 1978 
(Culex pruina). 
L’intervalle de 3 années qui a séparé les deux poussées à caractère 
épizootique peut correspondre au temps nécessaire au renouvellement de 
la population simienne non immune, nécessaire au processus d’amplification 
virale. On constate que des poussées épizootiques peuvent se produire 
deux années consécutives (1979-1980). I1 est alors à remarquer qu’après 
une intense activité du virus en fin de la saison des pluies en 1979, le virus 
apparaît en 1980, plus précocement que l’année précédente. Une telle 
distribution des souches virales est en faveur du processus de la transmis- 
sion transovarienne, tel qu’il existe pour d’autres Bunyavirus [ 81. 
Le mécanisme du maintien à (( bas bruit 1) du virus Bozo dans les galeries 
forestières au cours des années 1977 e t  1978 répond probablement à des 
processus complexes faisant in tervenir des hôtes vertébrés etlou des vec- 
MOTS-CLÉS' : Virus Bozo, Arbovirus, Aedes aegypti;  République Cen- 
trafricaine, Transmission expérimentale. 
REMERCIEMENTS 
Les auteurs remercient le Professeur L. Chambon et le Docteur P. Bres pour 
les critiques et corrections qu'ils ont bien voulu porter à ce manuscrit. 
BIBLIOGRAPHIE 
[l] CASEY, H. L., Standardized diegnostic complement fixation method and 
adaptation to microtest. Public Health Monograph no 74. US Government 
Printing Ofice, Washington. 
Ann. Viral. (Inst. Pasleur), I 3 4  E ,  no 2, 1983. 16 



Le virus Bozo (ArB 7343) : un nouvel arbovirus du groupe Bunyamwera isolé en République Centrafricaine; sa transmission expérimentale par Aedes aegypti

Le virus Bozo (ArB 7343) : un nouvel arbovirus du groupe Bunyamwera isolé en République Centrafricaine; sa transmission expérimentale par Aedes aegypti

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