Une nouvelle substance antitumorale a été isolée d'une Eponge néo-calédonienne, #Pseudaxinyssa cantharella$. Sa structure a été établie à l'aide de ses caractéristiques spectrales et par préparation de dérivés sélectivement substitués. (Résumé d'auteur

Ahond, A.

Bedoya Zurita, M.

Colin, M.

Fizames, C.

Laboute, Pierre

Laurent, Dominique

Lavelle, F.

Potier, P.

Poupat, C.

Pusset, J.

Pusset, M.

Thoison, O.

Horizon / Pleins textes

. -  
i 
C. R. Acad. Sci. Paris, t. 307, Série II, p. 145-148, 1988 145 
Chimie organique bio1ogiquelBioorganic Chemistry 
La girolline, nouvelle substance antitumorale extraite de 
l'ÉPonge, Pseudaxinyssa cantharella n. sp. (Axinellidae) 
Alain AHOND, Manuel BEDOYA ZURITA, Michel COLIN, Christian FIZAMES, 
Pierre LABOUTE, François LAVELLE, Dominique LAURENT, Christiane POUPAT, 
Jacques PUSSET, Michelle PUSSET, Odile THOISON et Pierre POTIER 
Résumé - Une nouvelle substance antitumorale a été isolée d'une Éponge néo-calédonienne, 
Pseudaxinyssa cantharella. Sa structure a été établie à l'aide de ses caractéristiques spectrales et par 
préparation de dérivés sélectivement substitués. 
Girolline, a new antitumoral compound extracted from the Sponge, Pseudaxinyssa 
cantharella n. sp. (Axinellidae) 
Abstract - The Sponge, Pseudaxinyssa cantharella, collected in New Caledonia, had earlier been 
shown to contain sterols and various pyrrole and imidazole metabolites. From the crude ethanolic 
extract, a anti-tumoral substance has now been isolated, named girolline, to which structure 1 has been 
assigned. 
Girolline, C,H,,ClN,O, is present in the organism as a hygroscopic hydrochloride, but forms a 
crystalline bis-camphosulfonate. Its structure is essentially deduced front the H ,  13C and I5N-NMR 
spectra: it is confirmed by the preparation of several derivatives: girolline reacts with adamantyl 
fluoroformate to give a mixture of "di- and tri-adamantyl" derivatives, the first of which provides, 
upon treatment with acetic anhydride and pyridine, an O-acetyl and an N,O-diacetyl 
derivatives. Similar results have been obtained by treatment of girolline with 2,4-dinitro-fluorobenzene, 
which gives a bis-(dinitrophenyl) derivative, acetylated to its O-acetate. 
The girolline is active on P388 leukaemia in vitro and in vivo. 
L'étude d'une nouvelle Éponge néo-calédonienne, décrite récemment par C. Lévi sous 
le nom de Pseudaxynissa cantharella [l], a déjà conduit à identifier plusieurs stérols [2] 
ainsi que divers métabolites pyrroliques et imidazoliques [3]. Aucune de ces substances 
ne présente d'activité cytotoxique, alors qu'une telle activité a pu être décelée sur l'extrait 
brut. 
Là poursuite du fractionnement de l'extrait brut, contrôlé à chaque étape par un test 
d'activité et par une analyse en RMN [4], a conduit à l'isolement d'un dérivé nouveau 
de I'amino-2 imidazole que nous avons appelé girolline et qui répond à la formule 1 [5]. 
L'ÉPonge, congelée dbs sa récolte, a été broyée et lyophilisée. Son extrait alcoolique 
est chromatographié sur silice et filtré sur (( Sephadex LH20 P : on obtient ainsi une 
poudre blanche, [[a];'+ 7,9" (méthanol, c =0,84) ; pK, 6,6 et 8,3], très hygroscopique 
(0,5 g/kg d'ÉPonge congelée), dont l'analyse montre qu'il s'agit d'un chlorhydrate. 
Celui-ci n'a pas été obtenu sous forme analytiquement pure mais la base libre a donné . 
avec l'acide D-camphosulfonique un sel cristallisé 2, F = 212"C, [ali0 + 34"(méthanol, 
c = 0,6) dont la composition centésimale [6] montre qu'il s'agit du bis-camphosulfonate 
d'un produit C,H, ,ClN,O. 
La structure de la girolline a été établie essentiellement par l'étude des données 
spectrales de résonance magnétique nucléaire (RMN) (tableau) et de masse : 
- L'étude du spectre de RMN du proton et celle des découplages 'H-'H en mode 
normal et par différence [4], celle des spectres de RMN du carbone-13 (spectre de bruit, 
spectre avec découplage partiel, spectre sans découplage et intégration des carbones) [7] 
ainsi que celle du spectre de corrélation 'H-13C et enfin celle du spectre de l'azote-15 (en 
0249-6305/88~03070145 8 2.00 0 Académie des Sciences 
-' ORSTQM Fonds Documentaire 
Note présentée par Guy OURISSON. \ \ 
146 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 307, Série II, p. 145-148, 1988 
découplage total) [7] ont conduit à proposer une structure d'amino-2 imidazole substitué 
en position 4 par une chaîne amino-1' chloro-2' hydroxy-3' propyle. La position du chlore 
a été fixée en 2' au vu de la constante de couplage J,,,-,= 154 Hz [8], bien différente de 
J,-I,-H et J,-,-,= 147 et 146 Hz. 
- L'étude du spectre de masse en bombardement atomique rapide montre un pic à 
MH" 191 et un pic dimère (2M+H)+ à 381. Celle du spectre de masse en désorption- 
ionisation chimique, avec l'ammoniac NH, comme gaz vecteur, montre un double pic B 
MH' 191, 193 d'intensités caractéristiques des isotopes d'un chlore. Le même spectre, 
avec ND, comme gaz vecteur, permet l'observation d'un pic principal à MD" 198 qui 
confirme la présence de six protons échangeables dans la molécule (2NH,, 1NH et 
1OH) [9]. 
La girolline comporte plusieurs fonctions acylables : elles ont été fonctionnalisées 
sélectivement par des réactifs spécifiques. Le dinitro-2,4-fluorobenzène 3 réagit sur la 
girolline-base en donnant un dérivé bis-(dinitrophénylé) 4 qui est N,O-diacétylé par 
l'anhydride acétique dans la pyridine en dérivé 5 [lo]. La girolline (15 mg, 0,08 mmole) 
en solution aqueuse bicarbonatée (pH 8-9) est traitée par le fluoroformiate d'adamantyle 
6 (47,6 mg, 0,24 mmole) ajouté en trois fois en solution dans le dioxanne. Après 6 h A 
température ambiante, on obtient, après extraction par l'éther puis chromatographie sur 
, couche épaisse de silice, deux produits : un dérivé (< diadamantylé )) 7 (9 mg) et un dérivé 
a triadamantylé )) 8 (7,3 mg) [ll]. Le premier, 7, traité par l'anhydride acétique et la 
pyridine, fournit deux produits : un dérivé mono-O acétylé 9 et un dérivé di-N,O-acétylé 
10 [12]. Tous ces produits, dont aucun n'a pu étre cristallisé, donnent par bombardement 
atomique rapide (FAB) ou par ionisation chimique (pour 9 et 10) des spectres de masse 
compatibles avec les formules indiquées [SI. Notons que l'acétylation de l'hydroxyle se 
traduit, dans tous les cas, par un déplacement du signal attribué au proton en 3' d'un A6 
d'environ 1,l à 1,35. 
Tout ceci nous permet de confirmer pour la chaîne propyle les positions d'une amine 
en l', du chlore en 2' et de l'hydroxyle en 3'. 
. 
en RMN. 
1. I , 
C. R. Acad. Sci. Paris, 't.'307, Série 11: p. 145-148, 1988 147 
~~ ~~ 
TABLEAU 
6% Multi- 6'H Multi- ' 6"N 
( plicité J(Hz) ( plicité J(W (10-6) 
. . . . . . . . .  - 151,3 1 
. . . . . .  - 71,4 2 a . .  - - 
. . . . . . . . .  - - 151,3 3 
4 . .  . . . . . . .  126,25 d ép. 6 
5 . . . . . . . . .  113,25 d 202 6,80 d 1 
1' 44,4 t 147 3,48 dd 13,7 et 9,4 
. . . . . .  - 47,6 l ' a .  - - - - - 
- - - 
- - - - 2 . .  . . . . . . .  148,03 d ép. 7 
- - I 
- - - - 
- - - - 
- 
- . . . . . . . . .  
3,64 dd 13,7 et 3,3 - 
- 2' . . . . . . . . .  61,2 dd 154 et 4 4,62 dt 9,4 et 3,3 
3' . . . . . . . . .  67,3 d 146 5,19 dd 3,3 et 1 - 
RMN I3C 
RMN 'H à 400 MHz, D,O (à 4,83). 
RMN "N B 40 MHz, D,O avec NH,Cl comme référence externe. 
100,l MHz, D,O avec dioxanne et TMS comme référence externe. 
La girolline s'est montrée active in vitro sur les cellules leucémiques P 388 à des 
concentrations de 0,001 à 1 pg/ml; cette activité a été confirmée in uivo chez la Souris 
greffée avec des cellules leucémiques P 388 à des doses voisines de 1 mg/kg par voie 
intrapéritonéale. 
Note reçue le 18 avril 1988, acceptée le 22 avril 1988. 
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 
[l] C. LÉvI, Bull. Mus. natn. Hist. nat., Pans, 4' série, 5, 1983, p. 719-722. 
[2] G. DE NANTEUIL, A. AHOND, C. POWAT, P. POTIER, M. PUSSET, J. PUSSET et P. LABOUTE, Tetrahedron, 
[3] G. DE NANTEUIL, A. AHOND, J. GUILHEM, C. POUPAT, E. TRAN Huu DAU, P. POTIER, M. PUSSET, 
[4] Spectres enregistrés sur l'appareil expérimental 400 MHz I.E.F. Orsay, aimablement m i s  à notre disposi- 
[5] Brevet Rhône-Poulenc Santé, FR 2.585.020, 18 juillet 1985. 
[6] C,6H,,ClN,0,S,; Microanalyse : C : 473; H, 6,4; C1 : 5,6; N : 8,7; O : 21,s; S : 9,6 (Calc C : 47,6; 
[q Les spectres de RMN de 13C et de lSN ont été aimablement enregistrés sur spectromètres (( Brüker WP 
[8] W. H. GERWICK, Phytochemistry, 23, 1984, p. 1323-1324. 
[9] Les spectres de masse ont été aimablement enregistrés sur appareils (( A.E.I. MS 9 )> et (( Kratos MS 50 )) 
par M. P. Varenne (I.C.S.N.) et M. M. Vuilhorgne (R.P.S.). 
[lo] Dérivé bis-(dinitro-2,4 phényle) 4 : R,=0,23 dans CH,Cl,/MeOH : 8/2; [ollD O" (MeOH); S.M. FAB : 
523, 525; RMN'H (400 MHz, CD,O) 6.  low6 : 3,86 (dd, J=15 et 7 Hz, 1 H, Cl.-H), 4,O (dd, J= 15 et 5 Hz, 
l H ,  C,,-H), 435 (m, l H ,  Cy-H), 4,80 (d, J = 5  HE, l H ,  C,.-H), 6,83 (s, l H ,  C,-H), 7,23 (d, J=9 Hz, 
l H ,  C6,,,-H), 7,97 (d, J=9 Hz, l H ,  C6,,-H), 8,35 (dd, J = 9  et 3 Hz, l H ,  C,,,,-H), 8,70 (dd;J=9 et 2,5 Hz, 
l H ,  C,,,-H), 8,98 (d, J = 3  Hz, 1 H, C,,,,-H), 9,08 (d, J=2,5 Hz, 1 H, C3,,-H). Dérivé bis-(diniho-2,4phénylé) 
N,O-diacétylé 5 : R,=0,60; IR (CHC1,) : 3 350, 1735, 1710, 1610 cm-'; RMN'H (200 MHz, CD,O) 6. : 
1,9 et 2,16 (2s, 2x3H,  2 COCH,), 3,9 [m, 2H, Cl.-H(2)], 4,s (m, l H ,  C,.-H), 6,14 (d, J=7,5 Hz, l H ,  
J=9,5 et 2,5 Hz, l H ,  C,,,,-H), 8,73 (dd, J=9  et 2,5 Hz, l H ,  C5,,-H), 9,03 (d, J=2,5 Hz, l H ,  C,,,,-H), 
[ l l]  Dérivé (( diadamantylé B 7 : R,=0,27 dans CH,Cl,/AcOEt : 1/1; S.M. FAB : 547, 549; RMN'H 
: 1,67 et 2,18 (2 m, 15H de l'adamantyle), 3,4 et 3,73 [2 m, 2H, Cl.-H(2)], 4,37 
41, 1985, p. 6035-6039. 
. -  J. PUSSET et P. LABOUTE, Tetrahedron, 41, 1985, p. 6019-6033. 
tion par MM. $.-K. Kan et M. J. Sauzade. 
H : 6,5; C1 : 5 4 ;  N : 8,s; O : 20,O; S : 9,7). 
et WM 400 )> par Mme C. Fontaine et MM. J.-C. Beloeil et E. Guittet. 
CSe-H), 7,2 (d, J=9,5 Hz, l H ,  C6,,,-H), 7,56 (s, l H ,  C,-H), 7,95 (d, J = 9  Hz, l H ,  C6,,-H), 8,37 (dd, 
9,12 (d, J=2,5 Hz, l H ,  C3rP-H). 
(200 MHz, CDC1,) 6. 
C. R., 1988, 2' Seniestre (T. 307) Série II - 11 
148 C. R. Acad. Sci. Paris, t. 307, Série II, p. 145-148, 1988 
(m, l H ,  C,.-H), 4,77 (d, J = 2  Hz, l H ,  C,.-H), 6,96 (s, 1 H, C,-H), 4,46, 5,5 et 5,9 (3 m, NH et OH). 
Dérioé <( triadamantylé N 8 : R,=0,81; [~ ]~+12 ,6 '  (CHCl,, c=3,1) S.M. FAB : 725, 727; RMN'H (200 MHz, 
CDCl,) 6. : 1,7 et 2,25 (2 m, 15 H de I'adamantyle), 3,48 [m, 2H, CIt-H(2)], 4,47 (m, l H ,  C,.-H), 
5,67 (d, J = 6  Hz, l H ,  C,.-H), 6,96 (s, l H ,  C,-H), 5,30 (m, l H ,  NH), 5,87 (m, 2H, NH). 
[12] Dérivé mono-0-acetylé 9 : R,=0,60 dans CH,Cl,/AcOEt : 1/1; SMIC : 589, 591; RMN'H (200 MHz, 
CDCl,, 6. : 1,6 et 2,17 (2 m, 15 H de I'adamantyle), 2,25 (s, 3 H, COCH,), 3,43 [m, 2 H, C,,-H(2)], 
4,47 (m, 1 H, C,,-H), 5,85 (d, J-6 Hz, 1 H, C,.-H), 6,92 (s, 1 H, C,-H), 5,15 et 5,77 (2 m, NH). Dérioé 
di-N,O-acétylé 10 : R,=0,63; SMIC : 631, 633; RMN'H (200 MHz, CDCl,) 6. : 1,65 et 2,18 (2 m, 15 H 
de l'adamantyle), 2,28 et 2,47 (2.s, 6 H, 2xCOCH,), 3,5 [m, 2 H, Cl,-H(2)], 4,55 (d ép., J=6  Hz, 1 H, 
C,.-H), 6,O (d, J = 6  Hz, 1 H, C,,-H), 7,lO (s, 1 H, C,-H), 5,20 et 9,65 (2 m, NH). 
A. A., M. BZ., C. P., O. T. et P. P. : Institut de Chimie des Substances naturelles du C.N.R.S., 
91 198 Gifsur-Yoette Cedex; 
M. C., C. F. et F. L. : Rhône-Poulenc Santé, 13, quai Jules-Guesde, 94400 Vitry; 
P. L. et D. L. : Centre O.R.S. T.O.M., B.P. no A5, Nouméa Cedex, Nouoelle-Calédonie ; 
M. P. et J. P. : Laboratoire des Plantes médicinales du C.N.R.S., B.P. no 643, Nouméa, Nouvelle-Calkdonie, 
adresse actuelle : I.C.S.N., 91 190 Gij-sur-Yvette. 


La girolline, nouvelle substance antitumorale extraite de l'éponge, Pseudaxinyssa cantharella n. sp. (Axinellidae)

La girolline, nouvelle substance antitumorale extraite de l'éponge, Pseudaxinyssa cantharella n. sp. (Axinellidae)

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