La régénération des plantes de SESBANIA ROSTRATA à partir de cals issus de fragments de tiges est obtenue. Le procédé d'isolement et de culture de protoplastes de mésophylle foliaire est décrit. Il permet d'obtenir des protoplastes viables qui se divisent activement en formant des colonies cellulaires, puis des cals. Après transfert des cals sur différents milieux de régénération, on observe la formation de pro-embryons, de structures ressemblant à des bourgeons ainsi que, plus rarement, des pousses ou des racines. (Résumé d'auteur

Bouvet, Philippe

Cas, Geneviève

Hanower, Janina

Horizon / Pleins textes

C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, no 10, 1986 429 
PHYSIOLOGIE CELLULAIRE VÉGÉTALE. - Culture de tissus et de protoplastes 
de Sesbania rostrata. Note de Janina Hanower, Geneviève Cas et Philippe Bouvet, présentée 
par Roger Gautheret. 
La régénération des plantes de Sesbania rostrata à partir de cals issus de fragments de tiges est obtenue. Le 
procédé d'isolement et de culture de protoplastes de mésophylle foliaire est décrit. I1 permet d'obtenir des 
protoplastes viables qui se divisent activement en formant des colonies cellulaires, puis des cals. Après transfert 
des cals sur différents milieux de régénération, on observe la formation de pro-embryons, de structures 
ressemblant à des boûrgeons ainsi que, plus rarement, des pousses ou des racines. 
PLANT CELL PHYSIOLOGY. - Tissue and protoplast culture of Sesbania rostrata. 
Plants were regenerated fiorn stein derived callus of Sesbania rostrata. Protoplast culture technique for further 
Mesophyll protoplasts isolated from greenhouse grown 
Only pro-embryo- and 
use in soinatic fnsion with other Sesbania was developed. 
plants of S. rostrata divided and forineil callus but were recalcitrant to regeneration, 
bud-like formations and rare shoots or roots were observed. 
INTRODUCTION. - Sesbania rostrata est une Légumineuse tropicale annuelle originaire 
d'Afrique de l'Ouest. Elle pousse spontanément dans la région du Sahel, dans les 
sols inondés pendant la saison des pluies. Son intérêt particulier réside en sa capacité 
exceptionnellement élevée de fixer l'azote atmosphérique grâce à la présence de deux 
types de nodules à Rhizobium, racinaires et aériens, ces derniers très abondants, disposés 
le long de la tige [l]. 
Les essais d'utilisation de S .  rostrata en tant qu'engrais vert dans les rizières, au 
Sénégal, se sont montrés très probants. 
I1 aurait été intéressant de pouvoir transmettre ce caractère particulier de S .  rostrata à 
d'autres espèces du genre utilisées comme fourrage ou comme engrais vert dans les 
régions tropicales, en faisant appel aux techniques d'hybridation somatique. L'objectif 
du présent travail a été d'élaborer un procédé d'isolement et de culture de protoplastes 
en vue d'une telle hybridation. A notre connaissance, aucune étude concernant les 
protoplastes du genre Sesbnnia n'a été, à ce jour, réalisée. 
Au préalable, nous avons étudié le potentiel de régénération in vitro de S .  rostrata, en 
culture de tissus. 
MATERIEL ET TECHNIQUES. - Matériel végétal. - Les graines de Sesbania rostrata sont trempées pendant 
1 h dans l'acide sulfurique concentré, rincées à l'eau et placées à l'étuve à 30°C. .Après germination, les plantes 
sont cultivées en serre chauffée (25°C) à Bondy, sous faible éclairage et arrosage abondant. 
Prélèvenient et culture des fragments de tiges et régénération des plantes. - Les entre-nœuds sont prélevés 
sur la partie médiane de la tige des plantes âgées de 3-4 mois. La désinfection à l'eau de Javel à 12" est suivie 
de rinçages à l'eau stérile. A différentes étapes de culture, le milieu de Murashige et Skoog [2] est utilisé avec 
variantes ne portant que sur les hormones. Les fragments de tiges de 1 à 2 cm de longueur sont mis en 
culture sur milieu gélosé contenant benzylaminopurine (BAP) (1 mg. 1-') et acide ß-indole butyrique (AIB) 
(0,05 mg.1-'). Les cals obtenus sont transférés sur milieux contenant BAP (0,25 à 2 mg.1-') et acide a-naphta- 
lene acétique (ANA) (0,5 à 2 mg.1-'). L'induction des racines sur les pousses feuillées formées est réalisée en 
milieu liquide, en présence de 5 mg. 1-' d'ANA. La rhizogénèse a lieu sur milieu sans hormones, dilué au demi 
et gélosé. Les plantes ainsi produites sont transférées en serre, sur terreau. 
Isoleinent et culture de protoplastes de inésophylle foliaire et essais de régénération. - Les protoplastes sont 
isolés à partir de jeunes feuilles bien! dépliées (2e-3e à partir du sommet) de plantes âgées de 2 à 4 mois, au 
stade végétatif ou à la floraison. On laisse flotter les feuilles, soit sur H,O 131, soit sur une solution de sels de 
Frearson [4] additionnée de mannitol (0,4 à 0,6 M), pH=5,8, à l'obscurité, à la température ambiante, pendant 
6 à 8 h précédant l'attaque enzymatique. Après immersion des feuilles dans l'alcool a '70%, désinfection 
largeur sur une toile de nylon immergée dans la solution de sels de Frearson-mannitol, puis mises en ' 
0249-6313/86/03030429 
. '  
_ _  
l'hypochlorite de calcium à 5 % et rinçages à l'eau stérile, les folioles sont découpées en lamelles de 1-2 mm & m ~ . $ . ~ m ~ . & d  
ubat' n hd§ &lommi$tre 
$2.00 @ Académie des Sciences 
430 C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, no 10, 1986 
~ ~ ~~ 
avec des enzymes. La solution enzymatique est constituée de : Cellulase Onozuka R-10 (273, Driselase (0,25%), 
Hemicellulase (1 Yi), Macerozyme R-10 (0,5%) et Pectolyase Y-23 (0,15%), dissoutes dans la solution de sels 
de Frearson-mannitol. Elle est utilisée telle quelle pour l'attaque courte (3-4 h à 28°C) ou diluée au tiers avec 
la même solution pour l'attaque longue (14-16 h à la température ambiante). A la fin de la macération, les 
protoplastes sont libérés dans le milieu de culture sans hormones, recueillis par centrifugation (80 x g, 4 mn) et 
rincés deux fois dans les mêmes conditions. Les protoplastes peuvent également être purifiés sur gradient 
discontinu de Perco11 (30, 40 et 50%; 200 x g, 6 mn), mais avec pertes. Les protoplastes sont mis en suspension 
dans le milieu de culture à la densité de lo3 ml-' à 5 x lo5 m1-I. Deux milieux de culture sont utilisés : milieu 
de Belliard et Pelletier [5] simplifié, sans saccharose ni sérum albumine, et milieu de Kao [6]. Les deux sont 
additionnés de mannitol et (ou) de glucose à la pression molaire finale de 0,4 à 0,6 M, et de différentes 
combinaisons d'auxines et de cytokinines : acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2.4-D) (0,2 à 5,5 mg. I-l), ANA 
(1 à 2 mg.l-'), BAP (0,4 à 1 mg.I-'), Kinétine (1 à 2 mg.1-') et Zéatine (d,5 mg.1-l). Les protoplastes sont 
cultivés soit en gouttes de 50-100 p1 déposées au fond des boîtes de Petri, soit en film liquide mince, dans des 
boîtes multiloges ou dans des boftes de Petri prétraitées (( Greiner n, à la température de 27"C, sous différents 
éclairements (obscurité, lumière, et obscurité puis lumière). La culture de protoplastes est réalisées sans ou 
avec dilution progressive du milieu en apportant, à intervalles réguliers, du milieu frais à pression osmotique 
de plus en plus faible et renfermant un peu moins d'hormones [7]. Le taux de survie et l'efficacité d'étalement 
(nombre de cellules en division par rapport au nombre de protoplastes ayant survécu) sont mesurés 7, 14 et 
21 jours après la mise en culture. 
Les colonies cellulaires, les microcals (de 0,5 mm) ou les cals bien formés (de 2 à 3 mm), ayant grandi en 
milieu de culture liquide sont transférés sur divers milieux de culture solide ([2], [8], [9], [10],[11]) additionnés 
de différentes combinaisons d'auxines (2.4-D, ANA, acide ß-indole acétique (AIA), Picloram) et de cytokinines 
(BAP, Kinétine, Zéatine, 2-isopentényladénine (2iP)) et, parfois, d'autres substances actives (acide 2,3,5- 
triiodobenzoïque (TIBA), acide abscissique (ABA), Phloridzine). Ceci en vue de tenter une régénération. 
RÉSULTATS ET DISCUSSION. - Ciilture de fragments de tiges. - L'apparition des cals est 
observée 2 semaines après l'ensemencement. La callogenèse est abondante et concerne la 
quasi-totalité des fragments mis en culture. 5 à 7 semaines après le repiquage des cals 
sur le milieu de régénération contenant 0,5 mg.1-I d'ANA et autant de BAP, il y a 
. formation de bourgeons, puis de pousses feuillées (fig. 1 a-d), sur 15% environ de 
cultures. L'induction racinaire est effectuée par action d'ANA à 5 mg. 1-1 pendant 24 h. 
La rhizogenèse est rapide : elle est observée 2-3 jours après repiquage sur milieu dépourvu 
d'hormones. Les plantules, transférées en serre sur terreau, se développent normalement 
(Jig. 1 e), fleurissent et forment gousses et graines. 
Culture de protoplastes de mésophylle foliaire. - Le prétraitement des feuilles par 
flottement sur solution de sels de Frearson contenant du mannitol 0,55 M, suivi d'une 
EXPLICATIONS DE  PLANCHES 
Planche I 
Fig. 1. - Régénération des plantes à partir de cals issus de fragments de tige : (a-c) bourgeons et pousses 
Fig. 1. - Plant regeneration from steni-derived callus: (a-c) buds and shoots; ( d )  isolated single shoot before 
Fig. 2. - Évolution des protoplastes de mésophylle en milieu de culture liquide : (a) protoplastes après 
isolement; (b) allongement des cellules; (c) première division; ( d )  2e et 3' divisions; (e-i) microcolonies et 
colonies; (j-p) microcals et cals; ( r )  pseudo-bourgeons. 
Fig. 2. - Mesophyll protoplast development in liquid culture medium: (a) freshly isolated protoplasts; 
(b) lengthening of cells; (c) jìrst division; ( d )  2nd and 3rd divisions; (e-i) micro colonies and colonies; 
(j-p) microcallus and callus; (r)  bud-like formations. 
feuillées; ( d )  pousse feuillée isolée avant racinement; (e) plante régénérée, sur terreau. 
rooting; (e) regenerated plant growing in soil. 
PLANCHE I IPLATE I JANINA HANOWER 
Fig. 1 
Fig. 2 
I 
I 
Fig. 3 
C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, no 10, 1986 433 
Planche II 
Fig. 3. - Premières expressions d'embryo- et morphogenèse sur cals issus de protoplastes après transfert 
sur milieux de régénération : (a-e) pro-embryons et pseudo-bourgeons; ( f-k) pousses de différent aspect; 
( I ,  in) racines. 
Fig. 3. - Embryo- and rnorphogenic developinent of protoplast - derived callus on regeneration inedia: 
(a-e) embryo- and bud-like formations; ( f - k )  different forins of shoots; (l, ni) roots. 
incubation de 15 h dans la solution enzymatique diluée au tiers, à la même pression 
osmotique, permet d'obtenir de bons rendements de protoplastes viables : en moyenne 
3 à 4. lo6 g-' de poids frais de feuilles et jusqu'à 6 à 8 .  lo6 dans certains essais. Cette 
variabilité des résultats d'un essai à l'autre est liée, en partie au moins, aux conditions 
non contrôlées de culture en serre des plantes-mères. La population de protoplastes ainsi 
isolés est assez hétérogène, leur diamètre variant de 15 à 30 pm ( f i g .  2a). Les conditions 
optimales de culture sont les suivantes : densité des protoplastes de 5. lo4 ml-', film 
liquide en boîtes de Petri prétraitées, milieu de culture de Kao [6] avec modifications 
portant sur les teneurs en glucose (0,2 M) et en mannitol (0,35 M) et sur la formule 
hormonale (1 mg. 1-l de 2.4-D et 0,4 mg. I-' de BAP), température 27T,  obscurité 
pendant 10 jours suivie d'une exposition progressive à la lumière (de 100 à 1500 lx). 
Le taux de survie 7 jours après la mise en culture atteint 90 %. L'abaissement progressif 
de la pression osmotique du milieu par apports hebdomadaires d'un milieu frais s'avère 
nécessaire pour assurer les divisions cellulaires soutenues avec formation de colonies et 
de cals. Dans les conditions optimales décrites ci-dessus, on observe après 24 h un 
gonflement des protoplastes jusqu'à 40-50 pm de diamètre, vers le 2"-3" jour un allonge- 
ment (Jig. 2b),  puis, le 4" jour, les premières divisions cellulaires par clivage (Jig. 2c). 
2-3 jours plus tard, les secondes et les troisièmes divisions sont observées (Jig. 2 d ) .  Les 
divisions successives se poursuivent et conduisent à la formation des microcolonies 
( f i g .  2e-g), puis, vers le 10"-14" jour, à des colonies plus importantes constituées d'une 
trentaine de cellules-filles ( f ig .  2 h )  ou plus ( f i g .  2i). 
Entre le 7" et le 14" jour de culture, l'efficacité d'étalement passe de 58 à 83 %. 
Vers le 21'jour, les microcals apparaissent ( f i g .  2j, k) .  Leur croissance se poursuit en 
milieu liquide (Jig.  2 l-p). Une apparition de pro-embryons et de pseudo-bourgeons est 
parfois observée en milieu liquide ( f i g .  2 r )  mais leur développement reste bloqué. Environ 
8 semaines après l'initiation des CuItures, les cals sont transférés sur milieux solides. Un 
transfert plus précoce, au stade de colonies ou de microcals, s'avère infructueux. En 
moyenne 9 % de protoplastes produisent des cals. 
Aucun des nombreux milieux éprouvés n'a permis, à ce jour, une régénération de 
plantes. Néanmoins, des débuts d'embryogenèse et d'organogenèse se sont manifestés 
sous forme de pro-embryons, de structures ressemblant à des bourgeons (Jig. 3 a-e) et, 
plus rarement, de pousses ( f i g .  3 f - k )  ou des racines (Jig. 3 I-m). 
CONCLUSION. - Les résultats rapportés plus haut mettent en évidence une différence 
de comportement in vitro entre les tissus de tiges et les protoplastes de' mésophylle foliaire 
quant à la régénération de plantes. Alors que la régénération de plantes entières est 
relativement facile à obtenir après repiquages successifs sur trois milieux (ANA et BAP, 
ANA seul, et milieu exempt d'hormones), la régénération à partir des cals de protoplastes 
de mésophylle n'a pu être obtenue à ce jour. Aucune des séquences de milieux de 
régénération éprouvés, notamment celles utilisées avec succès chez d'autres Légumineuses 
434 C. R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Série III, no 10, 1986 
([3], [12], [13], [14], [15]), n'a conduit à la formation de plantes. En effet, seuls des débuts 
d'embryo- ou d'organogenèse ont été observés. 
Ces constations nous incitent à entreprendre une étude complémentaire sur la culture 
de protoplastes de tiges ainsi que sur celle d'explants foliaires. Cette recherche aurait les 
finalités suivantes : d'une part, parvenir à la régénération des plantes à partir des 
protoplastes, d'autres part, comparer les potentialités de régénération des tissus et des 
cellules d'un même organe. 
Nous remercions Y .  R. Dommergues du Laboratoire de Microbiologie des Sols ORSTOM/C.N.R.S. de 
Dakar de nous avoir fourni les graines de Sesbania rostrata en provenance du Sénégal. 
Reçue le 28 avril 1986, acceptée après révision le 7 juillet 1986. 
RÉFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 
[l] B. DREYFUS et Y .  DOMMERGUES, Comptes rendus, 291, série D, 1980, p. 767-770. 
[2] T. MURASHIGE et F. SKOOG, Phvsiol. Plant., 15, 1962, p. 473-497. 
[3] L. B. JOHNSON, D. L. STUTEVILLE, R. K. HIGGINS et D. Z .  SKINNER, Plant. Se. Lett., 20, 1981, p. 297-304. 
[4] E. M. FREARSON, J. B. POWER et E. C. COCKING, Deu. Biol., 33, 1973, p. 130-137. 
[5] G. BELLIARD et G. PELLETIER, Physiol. uég., 16, 1978, p. 441-448. 
[6] K. N. KAO, Molec. gen. Genet., 150, 1977, p. 225-230. 
[7] K. N. KAO et.M. R. MICHAYLUK, Z. Pflanzeiipliysiol., 96, 1980, p. 135-141. 
[SI H. UCHIMIYA et T. MURASHIGE, Plant Physiol., 54, 1974, p. 936-944. 
[9] O. GAMBORG, R. MILLER et K. OJIMA, Exp. Cell Res., 50, 1968, p. 151-158. 
[lo] R. U. SCHENK et A. C. HILDEBRANDT, Can J. Bot., 50, 1972, p. 199-204. 
[ l l ]  D. F. BLAYDES, Physiol. Plant., 19, 1966, p. 748-753. 
[12] M. PEZZOTTI, S.ARCIONI et D. MARIOTTI, Genet. Ag. ,  38, 1984, p. 195-208. 
[13] S. ARCIONI, M. R. DAVEY, A.V. P. DOS SANTOS et E. C. COCKING, Z. Pflanzenphysiol., 106, 1982, 
1141 D. W. R. WHITE, Poster Proe. 6th Intl. Protoplast Sj~ip. ,  1983, p. 59-60. 
[15] D. Y .  LU, M. R. DAVEY et E. C. COCKING, Plant Cell Reports, 1, 1982, p. 278-280. 
p. 105-110. 
Laboratoire de Physiologie de I'ORSTOM, 70-74, route d'Aulnay, 931140 Bondy. 
, 


Culture de tissus et de protoplastes de SESBANIA ROSTRATA

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Horizon / Pleins textes