Bossis, M.

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Accepté pour publication le 23 mars 1990. 
DISCRIMINATION  ENTRE HEERODERA  CAROTAE E T  H, CRUCIFERAE 
PAR L'ÉLECTROPHORESE (SDS PAGE) DE PROTÉINES SOLUBLES 
EXTRAITES  A  PARTIR  DE  KYSTES  INDIVIDUALISES 
Michel BOSSIS 
I N M ,  Laboratoire de  Recherches  de la Chaire de Zoologie, B.P. 29, 35650 Le Rheu, France. 
En culture  légumière de plein  champ, les infestations 
simultanées  par  plusieurs espèces de  nématodes  phyto- 
parasites, sont  fréquentes. Ainsi, dans les régions pro- 
ductrices de carones où diverses crucifères  entrent  dans 
la rotation  culturale, les sols peuvent  être  infestés  par  des 
kystes de Heterodera carotae Jones, 1950 et  de H. crucife- 
rue Franklin,  1945 en mélange. La reconnaissance  spéci- 
fique  est  alors  très difficile. Outre l'utilisation de tests 
biologiques qui  permettent  de  déceler les parasites sur 
les racines de leur plante hôte respective (technique 
longue à mettre en œuvre),  l'identification  peut se faire 
par la morphométrie  des juvéniles (Wouts & Weischer, 
1977), mais les critères pas  en compte, notamment la 
mesure de la partie  hyaline de la queue,  présentent  des 
variations  intraspécifiques  importantes  et les recouvre- 
ments  interspécifiques  ont possibles. De plus cela 
représente un travail  particulièrement long. Pour pallier 
, ces difficultés, une technique plus discriminante a été 
recherchke. Parmi les techniques  biochimiques  utilisa- 
bles en taxonomie  (Hussey, 1979), l'electrophorèse s'est 
avérée être un outil performant (Bergé & Dalmasso, 
1985), L'électrophorèse de protéines  dénaturées prove- 
nant  de kystes individualisés  a  été utilisée. 
Matériel  et  méthode 
Différentes  populations  franqaises  (cinq  pour H. 
carotae et quatre pour H, cruc$orae) sont élevées en 
chambre climatisée à 20-22 "C, sur leur plante hôte 
respective : Daucus carota cv. Nandor  pour H. carotae 
et Brassica oleracea cv. Brutor  pour H. cruciferae. 
Après lavage à l'eau distillée, le kyste est placé dans 
un  tube  de  1,l mm de diamètre  contenant une solution 
Revue  Nématol. 14 (2) (1991) 
de  Tris HC1 à 0,01Ml-' (PH 7.4) et  de  Chaps à 20 gl-'. 
Après broyage et  centrifugation à 5 O00 gpendant 3 min, 
on  ajoute 5 pl d'une  solution de dithioérytritol à 
0,15Ml-' et de SDS à 100 gl-' et on centrifuge à 
10 O00 g pendant 10 min. Les protéines sont alors 
dénaturées par trempage des tubes au bain-marie à 
100 "C pendant 5 min. Avant utilisation, le surnageant 
est mélangé à 10 pl d'une solution de saccharose à 
La technique  électrophorétique employée est celle de 
Laemmli (1970), avec gel de  concentration à A O/O et de 
séparation à 12,5 %, d'une épaisseur de 0,5 mm. La 
migration  est  contrôlée  par le déplacement du bleu de 
bromophénol. 
La coloration au nitrate  d'argent  est réalisée selon la 
technique  decrite  par  Heukeshoven  et  Demick (1985) et 
modifiée  par  Damerval e t  al. (1987). Le Rf des  bandes 
discriminantes  est  calculé  par  rapport à la migration du 
bleu de bromophénol. 
200 gl-l. 
Résultats 
Au  niveau  intraspécifique, on  ne décèle pas de diffé- 
rences  discriminantes au sein des  populations. 
Au niveau  interspécifique, quatre différences  princi- 
pales permettent  l'identification aisée de  chaque espèce 
(Fig. 1). On note une bande de Rf : 0,40, assez ténue, 
présente  chez H. carotae et  absente  chez H. cruciferae. 
Une deuxième  différence facile à repérer existe pour la 
bande  de Rf : 0,46 qui est  présente  pour  chacune  des 
espèces, mais de forte intensité pour H. carotae alors 
qu'elle est faible pour H. cruciferae. Inversement, la 
bande Rf : 0,49 est  plus  intense  chez H. cwciferae que 
325 
M. Bossis 
Cr ca 
0,40 
449 
0546 
0,71 
Fig. 1. Électrophorétogrammes de protéines dénaturées pro- 
venant de kystes individualisés (Cr = Heterodera cmciferae; 
ca = Heterodera carotae). 
chez H. carotae. Enfin,  une  autre bande  de FU : 0,71 est 
spécifique  de H. carotae. D’autres  différences  mineures 
existent, tant au niveau des Rf qu’au  niveau de l’inten- 
sité de certaines  bandes, mais elles sont si ténues qu’elles 
ne  pourraient  réellement  être  estimées  que  sur  des 
migrations plus longues et ne semblent pas présenter 
d’intérêt  supplémentaire  pour la discrimination  des deux 
espèces. 
Sur 482 kystes broyés individuellement, 466 ont 
donné  des  protéinogrammes  suffisamment  riches pour 
que l’identification de l’espèce soit  possible  sans  la 
moindre  ambiguïté,  soit une efficacité de 96,7 %. 
Discussion 
En utilisant des protéines natives et la coloration au 
naphthalène black, Trudgill et Carpenter (1971) ne 
326 
décelaient que quinze bandes pour des kystes de H. 
carotae et une vingtaine au total pour les différentes 
espèces analysées, ce qui est insuffisant pour pouvoir 
séparer électrophorétiquement ces deux espèces. Les 
résultats de Greet et Firth (1977) et ceux de Franco 
(1979) sont  de  même  nature. Avec une technique SDS 
PAGE  et  une coloration au bleu de Coomassie, il est 
possible de  détecter  jusqu’à 47 bandes  pour H. schachtii 
(Pozdol & Noel, 1984). L’électrophorèse en conditions 
dénaturantes (SDS PAGE) avec coloration au nitrate 
d’argent, qui est utilisée ici, est encore plus discrimi- 
nante puisqu’elle permet d’obtenir plus de 60 bandes 
nettes,  dont  au  moins quatre  peuvent servir à l’identifi- 
cation  spécifique de H. carotae et H. cruciferae. L‘emploi 
de cette technique de coloration au nitrate d’argent 
donne des nuances de couleur qui facilitent le repérage 
des  bandes  de  même  nature. Pour  une  grande partie du 
gel,  les bandes  sont  nettes;  toutefois la concentration des 
molécules les plus  petites se fait assez mal  dans la zone 
inférieure. 
L’intérêt de la technique proposée réside dans la 
possibilité d’établir des  échantillons de protéines  suffi- 
samment concentrés directement à partir d’un kyste 
individualisé. Certes, elle est beaucoup moins perfor- 
mante que la technique  bidimensionnelle  (Ohms & 
Heinicke, 1985), appliquée également à l’analyse d’un 
seul kyste, mais elle est  nettement  plus  simple à mettre 
en œuvre. On pourra l’utiliser en complément d’une 
analyse de sol pour  laquelle,  après  extraction  et tri des 
kystes, des électrophorégrammes individuels peuvent 
permettre de déterminer s’il y  a  mélange des deux 
espèces et, dans l’affirmative, d’estimer  le  pourcentage 
de chacune des deux. En cas d‘infestation très légère 
d’une des  deux espèces, et selon la précision recherchée, 
la taille de l’échantillon devra  être  définie  par  la  consulta- 
tion d’un abaque de la loi binômiale qui donnera le 
nombre  de kystes individualisés qu’il conviendfa d’ana- 
lyser. 
Bien que des  différences  existent  entre les populations 
de H. carotae, notamment  dans  leur  aptitude à provo- 
quer l’apparition de racines  econdaires (Bossis & 
Mugniéry, 1987), la  discrimination de variations  protéi- 
ques  entre celles-ci n’est pas  possible  par  cette  techni- 
que. Ces observations sont semblables à celles de Bakker 
et al. (1988) qui n’ont pas  décelé de variations  intraspéci- 
fiques par une technique SDS PAGE assez similaire, 
mais qui soulignent le fait que cette  technique est mieux 
reproductible  que  l’électrophorèse de protéines natives. 
Bien  entendu, la qualité du protéinogramme  dépend 
du contenu  en larves du kyste et l’analyse est  impossible 
lorsque celui-ci est  presque  vide; c’est  là une limite de 
la technique qui  ne  permettra  pas  de  déceler  des  popula- 
tions  très faibles présentes  dans  des kystes ne  contenant 
plus  que quelques larves viables. 
Revue Nématol. 14 (2) : 325-327 (1991) 
Électrophorèse  de protéines d’Heterodera  carotae et H. cruciferae 
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Discrimination entre Heterodera carotae et H. cruciferae par l'électrophorèse (SDS PAGE) de protéines solubles extraites à partir de kystes individualisés

Discrimination entre Heterodera carotae et H. cruciferae par l'électrophorèse (SDS PAGE) de protéines solubles extraites à partir de kystes individualisés

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