La contribution des techniques de la biologie moléculaire en Acarologie est présentée sur la base de résultats obtenus chez les acariens phytophages et prédateurs de phytophages. Différentes situations biologiques sont abordées : identification précise des espèces, élaboration de phylogénies, estimation de la variabilité génétique d'une espèce de prédateur utilisé en lutte biologique. (Résumé d'auteur

Gutierrez, Jean

Navajas, M.

Perrot-Minnot, M.J.

Horizon / Pleins textes

ANPP - TROISIEME CONFERENCE INTERNATIONALE 
SUR LES RAVAGEURS EN AGRICULTURE 
MONTPELLIER 7-8-9 DECEMBRE 1993 
APPORT DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE EN 
ACAROLOGIE APPLIQUEE A L'AGRONOMIE 
M. NAVAJAS, M.J. PERROT-MINNOT et J. GUTIERREZ 
Laboratoire d'Acarologie ENSA-M-INRA-ORSTOM 
2, Place Viala, 34060 Montpellier cedex 1, France 
RESUME 
La contribution des techniques de ia biologie moléculaire en Acarologie est 
présentée sur la base de résultats obtenus chez les acariens phytophages et 
prédateurs de phytophages. Différentes situations biologiques sont abordées: 
identification précise des espèces , élaboration de phylogénies, estimation de la 
variabilité génétique d'une espèce de prédateur utilisé en lutte biologique. 
Mots-clés: Acariens, Tetranychidae, Typhlodromus pyri, Biologie moléculaire. 
SUMMARY 
THE CONTRIBUTION OF MOLECULAR BIOLOGY IN A&?OLOGY 
APPLIED TO AGRONOMY 
The contribution of molecular biology techniques in Acarology is described 
using results obtained on phytophagous mites and predator of phytophagous 
mites. Different biological situations are approached: accurate identification of 
species, the establishment of phylogenies and appraisal of the genetic 
variability of a predatory species used in biological control. 
Key-words: Acari, Tetranychidae, Tjphlodromus p y i ,  Molecular biology. 
INTRODUCTION 
, I 
4 
La compréhension des mécanismes et des processus de fonctionnement des 
populations est un préalable nécessaire à la mise en place de stratégies de lutte 
contre les organismes nuisibles. L'analyse de la diversité génétique, de la 
structuration des populations ainsi que de l'évaluation des échanges enire les 
populations (migration, flux géniques) sont des caractères complémentaires 
d'autres approches biologiques (morphologie, écologie, dynamique des - 
populations), qui contribuent à appréhender la biodiversité -de I'agrosystème. 
Ces études permettent de miem cerner les entités biologiques avec lesquelles on 
travaille et d'analyser la nature des relations que ces entités ont entre elles. 
- 
METHODOLOGIE 
Les techniques de la biologie moléculaire mettent à notre disposition des outils 
performants pour définir les marqueurs génétiques qui sont à la base des études 
de diversité génétique. Dans les dernières années ces techniques se sont allégées 
et leur usage s'est généralisé, mais c'est surtout le récent développement de 
méthodes ultrasensibles comme la PCR (réaction de polymérisation en chaîne), 
qui ont rendu cette approche intéressante en Acarologie. La PCR permet de 
s'affranchir des difficultés méthodologiques liées à la petite taille des acariens, 
caractéristique qui est d'ailleurs commune à divers arthropodes ravageurs et 
auxiliaires. 
Les techniques de base qui sont impliquées dans l'étude de la diversité génétique 
chez les acariens peuvent se résumer comme suit: 
1. La PCR permet d'amplifier sélectivement in vitro une région définie du 
génome à partir de très petites quantités de matériel (Seiki, et al., 1988) (Figure 
2. Les produits de PCR sont ensuite séquencés et on accède ainsi au niveau le 
plus fin de variation du génome (figure 2). 
3. Analyse de données de séquence: les séquences propres à chaque entité 
étudiée (espèce ou population) sont alignées et les différences notées. Les 
relations phylogénétiques entre les taxons sont élaborées à partir de ces données 
(Felsenstein, 1988). 
4. Les marqueurs moléculaires RAF'D ("randomly amplified polymorphic 
DNA") (Williams et al., 1990) sont appliqués à l'analyse de la diversité 
intraspécifique. Comme la PCR, cette méthode consiste à amplifier des 
fragments d'ADN, mais à partir d'une seule amorce aléatoire. Si des mutations 
font apparaître des possibilités d'hybridation supplémentaire de l'amorce sur la 
matrice, des nouveaux segments d'ADN seront génèrés. Un polymorphisme du 
nombre de segments amplifiés sera alors révélé. Cette méthode permet 
potentiellement de déceler un polymorphisme important. Elle presente alors un 
grand intérêt pour assurer le suivi des individus dans les populations. 
1). 
648 
l .  
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M I  2 3 4 5 6  
7 - 3 -  
Figure 1: La PCR (réaction de polymérisation en chaîne) permet d'amplifier sélectivement 
in vitro une région d é f i e  du génome. Cette technique a été utilisée pour amplifier la 
région ITS2 de l'ADN ribosomique de 6 espèces d'acariens Tetranychydae. Pistes 1 à 
4: espèces du genre Tetranychus; pisles 5 et 6: espèces du genre Eotetranychus; piste 
M: marqueur de taille (lambda Hind III). 
Figure 1: PCR (polymerase chain reaction) enables selective amplification in vitro of a 
specific region of the genome. The technique was used to amplify region ITS2 in 
ribosomal DNA of 6 Tetranychidae mite species. Lines 1 to 4 species of the genus 
Tetranychus; line 5 and 6:species of genus Eotetranychus; line M: size marker 
(lambda Hind III). 
Figure 2: Séquences (partie 3' de l'ITS2 de l'ADN ribosomique) de quatre espèces 
d'acariens Tetranychidae (Navajas et al., 1992). Les séquences sont alignées par 
rapport à la séquence consensus et seuls les nucléotides qui en différent sont donnés; 
les nucléotides identiques sont notés par un tiret, les délétions par un point . LÆ 
logiciel MULTALIN Software (Corpet, 1988) a été utilisé pour les alignements. 
Figure 2: Sequences of part 3' of ITS2 region of ribosomal DNA in 4 Tetranychidae mite 
species (Navajas et al., 1992). The sequences are aligned with the consensus sequence 
and only differing nucleotides are given; identical nucleotides are indicated by a dash 
and deletions by a dot. MULTALIN sofware ((Corpet, 1988) was used for the 
alignments. 
649 
RESULTATS 
I.  Identification des espèces et établissement des relations phylogénétiques 
à l'intérieur de la famille Tetranychidae. 
La famille Tetranychidae inclut plusieurs espèces nuisibles à l'agriculture. Leur 
systématique a surtout été étudiée jusqu'à maintenant par des méthodes 
classiques utilisant des caractères morphologiques. Les relations 
phylogénétiques entre 19 espèces appartenant à 8 genres de la famille 
Tetranychidae ont pu être établies sur la base des séquences d'un fragment 
d'ADN mitochondrial (Figure 3A). Cet arbre confirme la séparation des familles 
des Tetranychidae et des Tenuipalpidae [Cenopalpus pulcher (Canestrini et 
Fanzago)], de même que celle de la sous-famille des Bryobiinae [Bryobia 
kksophilu van Eyndhoven et Petrobia hatTi (Ewing)] et de la sous-familIe des 
Tetranychinae [de Panonychus ulmi (Koch) à Tetranychus un'icae Koch]. I1 met 
ici en évidence l'éclatement du genre Ollgonychus en deux ensembles distincts. 
C'est ainsi que les espèces du groupe Ollgonychus ununguis (Jacobi), ravageurs 
de gymnospermes seraient proches des genres Punonychus et Mononychellus, 
tandis que les Ollgonychus vivant sur plantes herbacées devraient être 
rapprochés des Tetrunychm. 
Une étude en cours portant sur des prélèvements d'E0tetranychu.s caipini 
(Oudemans) effectués sur vigne permet de séparer ce taxon d'autres 
Eotetranychus morphologiquement identiques recoltés sur noisetier , érable, 
etc., si bien que cette espèce a probablement beaucoup moins de plantes hôtes 
qu'on ne le pensait. 
Une troisième sene de travaux, portant sur des séquences d'un fragment de 
l'ADN ribosomique, permet une analyse fine des relations à l'intérieur du genre 
Tetranychus, en separant Tetranychus viennemis Zacher (figure 3B). Ceci est 
confirmé par un nouvel examen de la morphologie de cette espèce et l'analyse 
de sa biologie. On retrouverait ici une des raisons pour lesquelles T. viennemis 
demeurerait plus sensible aux produits agrophamaceutiques que les autres 
Tetranychus, au point de disparaître des vergers les plus traités. 
2. Diversité géographique (Origine géographique des introductions de 
ravageurs) 
Le cas de I'acarien vert du manioc Mononychellus progresivus Doreste, espèce 
américaine introduite en Afrique, est abordé dans un deuxième travail présenté 
dans ce colloque (Navajas et al. ) . 
3. Diversité des auxiliaires utilisées en lutte biologique. 
Le polymorphisme génétique entre populations de l'espèce Typhlodronzus pyri 
Scheuten, acarien prédateur utilisé en lutte biologique a été estimé par des 
marqueurs RAF'D. Diverses amorces ont mis en évidence un polymorphisme 
entre quatre populations étudiées (figure 4) 
6 5 0  
l Y 
O lig ony  c hus g o  ssypi i  
B 
- 
Cenopa lpus  p u k l i t r  
I- Bryobia kassophilu 
Petrobia harti  
Panonychus ulmi 
Panonychus  c i t r i  
Oligonychus unungu i s  
Oligonychus platani  
Mononychellus progresivus 
Te t r a n y  c h u s  n e o  cal edonicus 
L- 
AíoncnycheUus pagresivus 
Tetranychus viennensis 
Oligonychus gossypii 
Tetranychus neocaiedoniau 
Tetranychus pacificus 
Tetranychus mcdanieli 
Tetranychus kanzawa 
Tetranuchus turkestani 
Tetranychus urticae 
Te t rany  c hus g loveri 
Figure 3: L'arbre construit sur la base des séquences d'ADN montre les relations 
phylogénétiques entre les espèces de Tetranychidae. A à partir d'un fragment de 350 
nucléotides du gène codant pour la cytochrome oxydase I (COI) mitochondriafe. B: à 
partir des séquences de l'lTS2 de l'ADN ribosomique. Les analyses phylogénétiques 
ont été réalisées avec l'ensemble de programmes PHYLIP version 3 . 5 ~  (Felsenstein, 
1993). 
Figure 3: The tree drawn up using the DNA sequences shows the phylogenetic relations 
between the Tetranychidae species. A: on the basis of a 350 nucleotides fragment of 
the gene coding mitochondrial cytochrome oxidase I (COI). B: on the basis of 
sequences of the lTS2 region of ribosomal DNA. Phylogenetic analyses were 
performed with all the P H n P  programs, version 3 . 5 ~  (Felsenstein, 1993). 
Te t ranychus  viennensis  
Te t r a n y  c hus mcdaniel i  
Tetranychus pac i f icus  .- 
- 
651 
marqueur de poids 
moléculaire (paires de bases) 
-500 
souche s s R R R R s S R T T A  A A R 
Figure 4: Polymorphisme des patterns d'amplification de l'ADN génomique générés par 
RAPD ("random amplified polymorphic DNA") dans quatre populations de 
Typhlodromus pyri. La flèche indique le marqueur OPA1 3-500 correspondant à 
une bande majeure reproductible et diagnostique de la souche R. Ce marqueur est 
présent dans la souche R et absent des souches A, T et S. Origine des populations: 
A Aude (France), R Champagne (France), S: Suisse, T: République Tchèque. Les 
différentes populations sont reproductivement compatibles. 
Figure 4: Polymorphism of amplification pattems of genomic DNA generated by 
RAPD (random amplified polymorphic DNA) in four populations of 
Typhlodromus pyri. The arrow shows marker OPAl3-500 corresponding to a 
major reproducible, diagnostic band in strain R. This marker is present in strain R 
but absent in strains A, T and S. Sources of populations: A: Aude (France); R: 
Champagne (France); S: Switzerland; T (Czech Republic). The different 
populations are reproductively compatible. 
CONCLUSIONS 
La biologie moléculaire doit apporter des nouveaux elements de reponse à des 
questions qui sont à la base d'une bonne gestion des populations des ravageurs et 
des auxiliaires: 
Clarification de la systématique et de la phylogénie. 
Détermination du statut spécifique des ravageurs observés sur différentes 
plantes hôtes et des niveaux d'échanges éventuels entre acariens de plantes 
cultivées et de plantes réservoirs. 
Estimation du niveau des échanges éventuels entre populations introduites et 
autochtones de prédateurs utilisés dans le cadre d'opérations de lutte 
biologique. 
0 
6 5 2  
REFEREN CES 
Corpet, F. (1 988) Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. 
Nucl. Acids Res., 16:10881-10889. 
Felsenstein, J. (1988) Phylogenies from molecular sequences: inference and 
reliability. Ann. Rev. Genet., 22521-565. 
Felsenstein, J. (1993) PHYLIP phylogeny inference package version 3Sp, Dept. 
of genetics; SK50, University of Washington, Seattle, Washington, USA. 
Navajas, M., Cotton, D., Kreiter, S. et Gutierrez, J. (1992) Molecularapproach 
in spider mites (Acari: Tetranychidae): preliminary data on ribosomal DNA 
sequences. Exp. Appl. Acarol., 3.521 1-218. 
Sa&, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchï, R., Hom, G. T., 
Mullis, K. B. et Erlich, H. A. (1988) Primer -directed enzymatic 
amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 
Williams, J. G. K., Kubelik, A. R., Livak, K. J., Rafalski, J. A. et Tingey, S. V. 
(1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as 
genetic markers. Nucl. Acids Res., 18:6531-6535. 
2391487-49 1. 
6 5 3  


Troisième conférence internationale sur les ravageurs en agriculture

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