Fargette, Denis

Givord, Louise

Kounounguissa, B.

Thouvenel, Jean-Claude

Van Regenmortel, M.H.V.

Horizon / Pleins textes

~ ~ 
. .  , .  ,' . .. .. . .  J~ . ,  . ' F 
*.I, .I 1 
I .-I . .  .. . . .. . .  . .  
. .  
. .  
. ... . . . .  . .  . .  .. .. . .  . 
. .  
. .. ' : .  . . .  . .  . . .  . .  . .  
G: 
B d .  Rech. Agron. Gembloux I19941 29 (2), 161-168 
9' Diagnostic d'infection à gemlnivirus à l'ade 
d'anticorps monoclonaux dirigés contre le virus 
de la mosaïque africaine du manioc 
L. GIVORD p), D. FARGEITE y), B. KOUNOUNGUISSA y), 
J.C. THOWENEL y), M.H.V. VAN REGENMORTEL 0
Résumé 
L'objectif du travail consiste en la mise au point d'un test de diagnostic du 
virus de la mosaïque du  manioc, utilisable à grande échelle sur le continent 
africain. Dans ce but, des anticorps monoclonaux ont été produits par fusion de  
lymphocytes de souris immunisées contre une souche africaine du virus de  la 
mosaïque du manioc (XCMV) et testés pour leur utilisation en DAS-ELISA. 
Certains des anticorps monoclonaux sélectionnés permettent la détection de  
l'ensemble des souches d'ACMV, ainsi que d'autres geminivirus. Un test DAS- 
ELISA utilisant deux anticorps monoclonaux a été optimalisé en vue de  son 
utilisation routinière pour la détection de 1'AC.W et d u  "tomato yellow leaf curl 
virus" a u  Sénégal. 
r, 
?*) 
Immunochimie. Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire d u  CNRS 
(IBMC). Rue Descartes, 15. F-67084 STRASEOURG Cédex (France). 
Scottish Crop Research Institute (SCRI). Invergowrie. DUNDEE DD2 5DA 
(United Kingdom). 
Institut National de la Recherche Agronomique '(INRA). BP 507. F-68021 
COLMAR (France). 
Communication présentée lors du  Symposium "Phytopathologie et Biologie 
moléculaire" organisé par le professeur J. SEMAL et qui eut lieu d u  29 juin au 
3 juillet 1992, à la Facult6 des Sciences Agronomiques de Gembloux. 
(,***) ORSTOM. Midan Ibn Afan 13. Dokki Cairo (Egypte). 
Fonds Documentaire ORSTOM 
162 L. GIVORD etal. 
1. Introduction 
DIAGNOSTIC D'INFECTION A CE!4INIVIRUS 
163 
Le manioc, plante pérenne originaire d'Amérique du  Sud, a été 
introduit par les Portugais en Afrique vers la fin du 16e siècle. C'est la 
première grande culture vivrière dans de nombreux pays d'Afrique ; dans 
les autres, il suit immédiatement le -sorgho, l'igname ou le riz. I1 s'agit 
d'une plante rustique qui se reproduit par bouturage et donne au bout de 
12 niois un faisceau d'énormes tubercules pesant chacun en moyenne 3 kg. 
Le grand avantage de cette culture est que les tubercules peuvent n'être 
récoltés qu'au bout de 18 à 24 mois, mettant ainsi à l'abri des dures 
périodes de soudure que connaissent bien les populations qui se nourris- 
sent de céréales. La racine de manioc est un aliment essentiellement 
énergétique ; les feuilles, beaucoup plus riches en nutriments, sont 
consommées à la façon des épinards. 
Le manioc est attaqué par plusieurs insectes, champignons ou virus, 
mais on ne lui connaît qu'une seule espèce d'acarien prédateur et une seule 
badériose phytopathogène. En f i q u e ,  la mosaïque du  manioc causée par 
un virus, en est la maladie la plus répandue et la plus importante (Photo 1). 
Elle provoque des pertes de rendement de 20 à 80 % et revient régulière- 
ment chaque saison. Ceci s'explique par le fait que le virus responsable est 
disséminé en même temps que la plante par la reproduction vegétative et 
parce qu'il est, de plus, transmis par un Aleurodidae, Berm'sr;? tabadGEN. 
qui pullule en début de saison des pluies, période la plus favorable pour 
la plantation du  manioc. 
La maladie, décrite pour la première fois en 1894 par WARBURG, a pu 
ètre transmise à des plantes saines par voie mécanique par BOCK et 
GUTHRIE, en Afrique de l'Est, en 1978. Le "cassava latent virus", nommé par 
la suite "African Cassava Mosaic Virus (ACMV)", décrit en tant que 
geminivirus, a fait l'objet d'un certain nombre d'études relatives à sa 
transmission par insecte, sa purification, son épidémiologie, la constitution 
et l'organisation de son ADN génomique, ainsi qu'à son diagnostic. Les 
études se rapportant directement à notre propos, c'est-à-dire le diagnostic 
de geminivirus à l'aide de tests immunoenzymatiques, sont les suivantes : 
i'une part, celles de SEQUEIRA et HARRISON [1982], THOWENEL e t d .  [1984], 
~ARGETTE et [1987] et KouNouNGurSsA el d. [1989], qui résultent de 
'utilisation des anticorps polyclonaux et d'autre part, celles de THOMAS el 
rl. [1986], HARRISON eld. [1991] et MUNIYAPPA e t d .  I19911 qui concernent 
'usage des anticorps monoclonaux (AcMc). 
Dans le cadre du programme de 1'ORSTOM pour l'éradication de 
'ACMV, notre objectif concerne la mise au point d'un test de diagnostic à 
rGde échelle, utilisable sur le continent africain. 
A? 
Les tests dlabor6s pkhdemment par notre groupe, en Côte-d'Ivoire 
et en France [TI IOUVENEI. eta/., 1984 ; F. - \Rc ;E~E e t  aJ., 1987 ; KCXJNOUNGUIS- 
S A  et n/., 19891, ne sont pas adaptés ce type de besoin, car ils sont tous . . .  _ _ .  
basés sur  l'usage des anticorps Fo1J.clonaux. 
Li 19%, TI lohl..\t; etnl .  du SCRI d e  Dundee (Ecosse) ont produit des 
AcMc dirigés contre une souche ACMV-JI, originaire d'Afrique de l'Est. 
Nous airons utilisé la même méthodologie, en recherchant des AcMc 
susceptibles d e  reconnaître un maximum de  souches ou d'isolats viraw 
d'origines cliverses. 
,i 
t 
! i
2. Matériels et méthodes 
Les Acbtc ont été produits Far fusion de lymphocytes de souris 
FALB/c, immunisées contre I'AChl\' (souche TAIS 30211, IITA, Nigeria), 
164 L. GIV3RD e t  a/. 
avec des cellules myélomateuses PAI [STOCKER etal., 19821. Le milieu de 
cdture des hybridomes est additionné de macrophages ; la sélection a été 
faite par dilution limite en phase liquide, par dew sous-clonages 
successifs. La présence d'AcMc dans les surnageants de culture a été testée 
simultanément par des tests ACP (Antigen Coated Mate) et DAS (Double 
Antibody Sandwich) ELISA. En ACP-ELISA, le virus purifié est directe- 
ment fixé au polystyrène des plaques de microtitration et constitue donc 
la première couche du test, tandis qu'en DASELISA, le virus est capté par 
des immunoglobulines G (IgG) de lapin, spécifiques de I'ACMV. Dans les 
deux cas, l'antigène est ensuite reconnu par un AcMc spécifique, lui-même 
mis en evidence à l'aide d'un anticorps anti-lgG de souris, conjugué à la 
phosphatase alcaline. Les hybridomes stables sélectionnés ont été 
reproduits en liquides d'ascites de souris. 
Les tests de reconnaissance d'isolats et  de souches de I'ACMV, ainsi 
que d'autres geminivirus, ont été réalisés àpartir d'extraits bruts de plantes 
virosées. 
3. Résultats et conclusions 
Tous les isolats de I'ACMV de la collection de I'ORSTOM de Côte- 
d'Ivoire, ainsi que de celle de l'INRA à Colmar (isolats originaires de Côte- 
d'Ivoire, du Kenya, de République Centrafricaine, du Togo, du Zaïre, de 
Madagascar et de l'Inde), sont reconnus par les AcMc développés à I'IIBMC 
de Strasbourg. Les réactions non spécifiques liées à l'extrait brut de plante 
saine (bruit de fond) sont toujours très faibles. .- 
Nous avons testé, en parallèle, la réactivité des AcMc de I'IBMC et 
du SCRI, h I'égard de plusieurs geminivirus originaires de différents pays 
(Tableau I). Conme 1'AcMc 20 du SCRI, les AcMc de la série 11 de I'IBMC 
ïecomaissent tous les genunivirus testés, quelles que soient leurs origines 
Séographiques ; i l s  sont donc dirigés contre un site antigénique commun 
i ces différents genunivirus. Par contre, 1'AcMc 7x1 ne reconnaît que les 
J inx  africains, il se rapproche de 1'AcMc 17 du SCRI. 
Une prenuère application de la reconnaissance de genunivirus 
iérérologues à l'aide des AcMc anti-ACMV de I'IBIMC, a été réalisée en 
Ygypte. Elle a permis de mettre en evidence le virus de I'enroulement de 
a tomate (!'Tomato Yelloiv Leaf Curl Virus" ou TYLCV) sur tomate, ainsi 
tue sur Althaea rosea CAV., qui présentait des symptômes rappelant ceux 
('un autre genGivirus, le virus de l'enroulement du gombo ("okra 1e.d 
ur1 virus"). Nous avons aussi pu détecter la présence d u  RLCV dans des 
chantillons de tomate en provenance du Burkina-Faso, du Sénégal, du  
d. 
__ -. 
DIAGNOSTIC D'INFECTION A GEAMINIVIRUS 165 
R I  + + +  :$$:+::I 
+ +  
+ + 3 +  2 + + + + + + I  + & + +  + 
2 + + l S l f l  +  + 
2 + 3  + I l l + l  + 
+ +  + 
+t + 
I 166 L. GIVORD et ai. 
al 
O 
((J 
O a -  
r 1  
e 
n 
Nigeria et de Sicile. Comme le montre la figure 1, pour la détection du 
WLCV (virus hétérologue) à l'aide d'AcMc de I'ACMV, il est cependant 
nécessaire de remplacer le tampon conventionnel de broyage des 
échantillons (PBS-Tween + PVP) par un tampon Tris-HC1 contenant un 
agent réducteur. 
Enfin, nous avons m i s  au point pour YACMV et le WLCV (Sénégal) 
un test DAS-ELISA utilisant deux anticorps..monoclonaux, ce qui nous 
permet de nous libérer de la limite quantitative liée à l'utilisation 
d'anticorps polyclonaux de lapin qui sont différents pour chaque animal 
immunisé. Ce test recourt ensuite pour la révélation à l'utilisation d'un 
AcMc anti-souris, couplé à la biotine et qui est révélé par la streptavidine. 
Bien qu'il soit légèrement moins sensible que le test DAS-ELISA utilisé 
précédemment, ce test permet cependant des détections à des dilutions 
élevées, et il est tout à fait adapté au diagnostic à grande échelle, notam- 
ment dans les pays en voie de développement, objectif que nous nous 
étions fixé. 
\ '  *. . .  '. .. . '. . .  . z . .  
Remerciements 
I Ce travail a été financé par une convention établie entre le CNRS et 
I'ORSTOM. Nous remercions Mme M.M. SWANSON pour nous avoir procuré les 
anticorps monoclonaux du  SCRI (Dundee). 
1 
~ Summary 
Diagnosis of  infechbn by geminiviruses by means of monoclonal antibodies 
raised againstAlrcan Cassava Mosaic Wms 
The aim of the work was to set up a detection test for Cassava mosaic virus 
which could be used on a large scale on the African continent. Monoclbnal 
antibodies (AcMc) were produced against an isolate of African Cassava Mosaic 
Virus (ACMV), and tested for use in DAS-ELISA. Some of these AcLMc allow the 
detection of all the different isolates of ACMV tested, and also of other gemini- 
viruses. A DAS-ELISA test using two monoclonal antibodies has been adapted for 
routine use for the detection of AClMV and Tomato Yellow Leaf Curl Virus in 
Senegal. 
167 DIAGNOSTIC D'INFECTION A GEMNVIRUS 
p,, 
1.5 
Ec 
In 
O 
P 
1 11 111 N 
.+ ...-..A ..... .. ---+--- 
'\ o 
\ .  
n I I l 
J 
Y 
1 1 o-' 10-2 1 1 o4 
Dilution 
Figure 1. - Importance du tampon de broyage de l'extrait brut de plantes virosées 
pour la détection du  virus de l'enroulement de la tomate (TYLCV) en 
test DAS-ELISA. Dilution en série, de 10 en 10. 
Influence of the buffer used for thepreparatbn ofplant extracts for 
the deteedion of tomatoyeflow leaf curl virus (TYLCI/) in DAS-ELISA. 
Traitement I : PBS-Tween (0,s %), 2 % PVP. 
Traitement II : 0,05 ìvl Tris-HC1 (pH S,O), 0,005 M EDTA, 2 O/O PVP, 
O,Ç % Tween. 
Traitements III et IV : 0,05 M Tris-HC1 (pH S,O), 60 mM sulfite de 
sodium, avec ou sans mercaptoéthanol (1 %). 
PBS = 0,137 ,M NaCI, 0,0027 IM KCI, 0,0043 M Na, HPO4.7H2O, 
0,0014 14 KH,PO, (phosphate-buffered salhe). 
PVP = polyvinyle pyrrolidone. 
Tris = Tris(hydroxyméthy1)-aminométhane. 
EDTA = Sel disodique de i'acide éthylènedinitrilotétraacétique. 
-.....,.. '. .:.. ,. ... .. , . , ....:... _ ' '  . . .  . .  . .  . .  . .  
. .  
168 L. GIVORD et al. 
Bibliographie 
BOCK K.R., GUTHRIE E.J. [1978]. Transmission of African cassava mosaic by 
mechanical inoculation. Plant Dis. Rep. 62,580-581. , 
FARGETE D., THOUVENEL J.C., FAUQUET C. [1987]. Vi& content of leaves of 
cassava infected by African cassava mosaic virus. AM. AppI. BioI. 110,65-73. 
HARRISON B,D., MUNIYAPPA V., SWANSON M.M., ROBERTS I.M., ROBINSON D.J. 
[1991]. Recognition and differentiation of seven whitefly-transmitted 
geminivirus from India, and their relationships to African cassava mosaic and 
Thailand mung bean yellow mosaic viruses. AM. AppI. BioZ. 118,299-308. 
KOUNOU?XUISSA B.R., GWORD L., WALTER B. [1989]. African cassava mosaic virus 
(AC-W) : stability of purified virus and improved conditions for its detection 
in cassava leaves by EL1SA.J Phytopathol. 1 2 7 , 2 9 4 .  
MUNIYAPPA V., SWANSON M.M., DUNCAN G.H., HARRISON B.D. [1991]. Particle 
purification, properties and epitope variability of Indian tomato leaf curl 
geminivirus. AM. AppZ. Bioì. 118,595-604. 
SEQUEIRA J.C., HARRK)N B.D. [1982]. Serological studies on cassava latent virus. 
AM. AppI. Biol. 101,3342. 
STOCKER J.W., FOSTER H.K., MIGGIANO V., STAHLI C., STAIGER G., TABACS B., 
STAEHELW T.H. [1982]. Generation of two new myeloma cell lines "PAI" and 
"PAI-O" for hybridoma production. Res. Disclosure 217,155-157. 
THOMAS J.E., MASSALSKI P.R., HARRISON B.D. [1986]. Production of monoclonal 
antibodies to African cassava mosaic virus and differences in their reactivity 
with other whitefly-transmitted geminiviruses.]. Gen. Vjroì.67,2739-2748. 
THOUVENEL J.C., FARCETTE D., FAUQUET C., MONTSARRAT .[1954]. Serological 
diagnosis of African cassava mosaic by immunoenzymatic method. Proc. Sixth 
Int. Trop. Root Crops Symp., 21-23 Feb. 1983, Lima, Peru, 353-356. 
WARBURG O. [1894]. Die Kulturpflanzen Usambaras. Mitt. Dtsch. Schutzgeb. 7, 
P 
131-198. 


Diagnostic d'infection à geminivirus à l'aide d'anticorps monoclonaux dirigés contre le virus de la mosaïque africaine du manioc

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Horizon / Pleins textes

Name not available