Díez Gibert, O.

Revistes Catalanes amb Accés Obert

Revisió de les tècniques de genètica molecular 
més habituals en el laboratori clínic  
 
O. Díez Gibert 
Servei de Genètica 
Hospital de la Santa Creu i Sant Pau 
Barcelona  
 
 
En l'estudi del DNA s'utilitzen elements indispensables (enzims de restricció, 
sondes genètiques, etc.) i el fenomen de la hibridació, és a dir, l'aparellament 
de seqüències de nucleòtids complementàries entre elles mateixes. 
 
Els enzims de restricció són endonucleases que tallen la doble cadena de DNA 
en els punts en els que existeix una seqüència de nucleòtids (diana de 
restricció), específica per a cada enzim i que aquest reconeix. Les sondes són 
fragments de DNA que s'aparellen amb el DNA d'interès en seqüències 
corresponents a un gen conegut o en zones del genoma de funció 
desconeguda, però que es troba a prop o adjacent a un gen d'interès. El 
marcatge previ, radioactiu o no, és útil per a la localització d'aquestes 
seqüències. Les dues cadenes de DNA poden dissociar-se (desnaturalització) 
per escalfament i reassociar-se in vitro per refredament. També poden formar-
se híbrids DNA-RNA. El procés de reassociació (hibridació) és altament 
específic i en condicions adequades té lloc només entre cadenes, les bases de 
les quals són complementàries. Les sondes s'uneixen als fragments 
complementaris del DNA en estudi gràcies al procés d'hibridació. 
 
La tècnica de transferència Southern permet la visualització de fragments del 
genoma. Consisteix en tallar el DNA amb un enzim de restricció, separar per 
electroforesi els fragments generats, transferir aquests a un suport sòlid 
(generalment una membrana de niló) i, posteriorment, hibridar amb una sonda 
marcada (amb 32P, digoxigenina, o altres). El senyal obtingut identifica el 
fragment de DNA d'interès, que s'haurà desplaçat d'acord a la seva grandària. 
Qualsevol variació implica algun canvi en la seqüència (un nombre anormal de 
dianes de restricció) o l'absència de seqüències específiques en el DNA en 
estudi. 
 
Una tècnica bàsica en el diagnòstic molecular és la reacció en cadena per la 
polimerasa o PCR (sigles de polymerase chain reaction). La tècnica de la PCR 
és un mètode capaç de produir in vitro un gran nombre de còpies d'un 
determinat fragment de DNA, del qual solem conèixer al menys els dos 
extrems, i facilitar d'aquesta forma les manipulacions posteriors. Per això 
s'usen, bàsicament dos encebadors (fragments oligonucleotídics, cada un 
complementari d'un dels extrems del fragment de DNA a amplificar) i una DNA 
polimerasa, capaç d'afegir a cada encebador nous nucleòtids, ja disposats en 
excés en la solució. Es realitzen de forma automàtica cicles repetits curts 
d'augment i disminució de la temperatura. El calor causa la desnaturalització de 
la doble cadena de DNA, mentre que la seva disminució porta a la hibridació 
dels encebadors a les seqüències complementàries del DNA d'interès ja 
desnaturalitzat. Els encebadors s'hibriden orientats de manera que l'addició de 
nous nucleòtids té lloc al llarg de la regió de DNA flanquejada pels encebadors, 
duplicant-se així, la quantitat de la seqüència original de DNA. El DNA 
sintetitzat és també complementari i capaç d'unir-se de nou als encebadors. 
Per aquesta raó, en cada cicle de desnaturalització-hibridació-síntesi es duplica 
la quantitat de DNA present en el cicle anterior. Mitjançant uns 30 cicles 
s'aconsegueix un nombre extraordinàriament alt de còpies d'un mateix 
fragment de DNA, amb la possibilitat de l'anàlisi posterior de la seva seqüència, 
per a la identificació de mutacions o altres variants. 
 
La tècnica d'examen dels polimorfismes de conformació de cadena senzilla és 
una de les més usuals. Consisteix en l'examen de la mobilitat electroforètica en 
gels de poliacrilamida de fragments de DNA prèviament amplificats mitjançant 
PCR. En cada electroforesi es compara un mateix fragment de DNA de 
diferents pacients. Una mobilitat diferent de qualsevol mostra respecte a les 
altres suggereix l'existència de canvis en la seqüència de nucleòtids del 
fragment corresponent i s'haurà d'analitzar per mitjà de la seqüenciació. Poden 
realitzar-se a més electroforesis en gels amb un gradient desnaturalitzant, ja 
sigui químic o tèrmic. La mostra, DNA de doble cadena, migra trobant-se amb 
un factor desnaturalitzant de forma creixent, fins un punt en el que les dues 
cadenes comencen a separar-se i s'endarrereix el seu avenç. Per tant, els 
canvis que pot presentar una mostra en la seva seqüència modifiquen el punt 
de la seva desnaturalització i la seva mobilitat respecte les altres. 
 
S'han dissenyat nombroses variacions i adaptacions d'aquestes tècniques 
electroforètiques, capaces de la identificació de fragments amb canvis en la 
seva seqüència. En tots els casos, les mostres que presenten un patró anòmal 
s'han de seqüenciar posteriorment per a caracteritzar de forma definitiva el 
tipus de canvi en la seqüència. 
 
Una altra de les tècniques utilitzades per a la detecció de mutacions és l'estudi 
de la proteïna truncada. Consisteix en l'amplificació mitjançant PCR de 
fragments grans de DNA, corresponents al gen en estudi, per mitjà 
d'encebadors dissenyats adequadament. Posteriorment, es realitza una 
incubació in vitro amb aminoàcids, un d'ells marcat, i lisats cel·lulars, obtinguts 
comercialment. En aquest pas es produeix la transcripció a RNA i la traducció 
final a proteïna, corresponent al fragment de DNA inicial. Finalment, es realitza 
una electroforesi de proteïnes marcades i s'examina la seva mobilitat. Si en el 
fragment de DNA inicial existeix una mutació causant d'una interrupció de la 
traducció, la proteïna sintetitzada és de menor longitud i migra més ràpidament 
en el gel. Aquesta tècnica, no obstant, no és útil per a detectar mutacions que 
comportin el canvi d'un aminoàcid per un altre, ja que en aquest cas la proteïna 
és anormal, però d'igual longitud. 
 
Per a l'estudi del RNA s'efectua la transferència Northern (anàloga a la 
transferència Southern), en la que les diferents cadenes de RNA d'un grup 
cel·lular o teixit es separen en una electroforesi, se transfereixen a una 
membrana i s'hibriden amb la sonda corresponent. Si es desitja amplificar un 
fragment específic de RNA, aquest pot usar-se com a motlle per a la síntesi de 
la cadena còpia (cDNA), per mitjà d'una transcriptasa inversa. El cDNA obtingut 
pot amplificar-se posteriorment amb la PCR. Aquesta tècnica, anomenada RT-
PCR (sigles de reverse transcriptase-PCR), ha estat àmpliament utilitzada tant 
per a la detecció de mutacions com per estudiar l'expressió de certs gens. 
 
 
 
 
Citació recomanada per a aquest document:  
 
Díez Gibert O. Revisió de les tècniques de genètica molecular més habituals en el laboratori 
clínic. In vitro veritas 2001;2, art. 9:<http://www.acclc.cat> 


Revisió de les tècniques de genètica molecular més habituals en el laboratori clínic

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Revistes Catalanes amb Accés Obert