Mestre i Espinach, Joan

Revistes Catalanes amb Accés Obert

MODIFICACIONS A LA T[+.CNICA
D'IMMUNOFLUORESCENCIA APLICADA
AL TOXOPLAS.\IA I RESULTATS
Comunicacio presentada el dia i8 de maig de 1967 per
JOAN MESTRE i ESPINACH
Cap de Laboratori de la Clinica Barraquer . Barcelona.
Sembla interessant dc precisar alguns aspectes relacionats amb el diag-
nostic serologic de la toxoplasmosi, giiestio que ens ocupa des del primer
cas descrit al nostre pals per BALLABRIGA i OPENHEIMER 1'any 1949.
El Toxoplasma es troba arrcu de la terra, si exceptuem els pa'isos esqui-
mals. El seu reservori es inesgotable, i, per tant, el contagi entre la pobla-
ci6 es molt gran.
El protozou fou descrit per primera vegada l'any igo8, simultaniament
i independentment, per SPLENDORE a Sao Paulo en el conill, i per NICOLLE
i MANCEAUx a Tunis en el Gondii. Aquests darrers autors li posaren el
nom de Toxoplasma per la seva forma d'art, i el classificaren en el grup
de les Leishmanies. L'any 1923, JANKu descobrf el parasit a la coriore-
tina d'un nen amb microoftalmia, que morf al cap d'onze mesos per hidro-
cefalia. El classifica com a esporozou o coccfdia. LEVADITTI, cinc anys
rues tard, en revisar les mateixes preparations, 1'identifica com el Toxo-
plasma Gondii descrit vint anys abans. Les dificultats d'aquesta primera
identificaci6 del parasit en 1'home demostren que no es facil de caracte-
ritzar el Toxoplasma per la seva morfologia en els teixits. Tambe cal
rernarcar que la primera forma coneguda d'una infecci6 sigui la forma
congenita. Amb aquesta troballa, la fase de les verifications necropsi-
qucs que acabaricn per confirmar l'existencia de la malaltia no feia sin6
comencar.
El diagnostic clinic no fou possible fins que es desenrotllaren les tec-
niques imniunologiques. La primera que conserva un interes purament
historic fou la prova de neutralitzaci6 de WARREN i SABIN, i la primera
prova de fixaci6 del complement de SABIN i RUCILMAN, fins a arribar a la
prova de SABIN i FELDMAN (The test) l'any 1948. D'aleshores enca els proce-
diments serologics s'han multiplicat, perque el Toxoplasma en els teixits
i per examen dirccte dificilment es distingeix dels detritus cellulars, d'al-
tres protozous o micets o de simples artefactes; cal identificar-lo per les
seves propietats biologiques, patogeniques i immunologiques.
Pot adoptar una forma vegetativa o proliferativa i una forma de resis-
tencia, qufstica, segons la situacio defensiva de 1'hoste. La forma vegeta-
tiva es fragil, de 2,5 a 7 mitres de longitud, per 2,5 a 4,5 d'arnple. Te
forma de croissant allargat, mes o menys arquejat, amb un extrem afilat
91
4 JOAN MESTRE I ESPINACH
i l'altre arrodonit; tambe pot mostrar-se ovalat, piriforme o fusiforme. Ps
unicellular, gram negatiu, i ohligatoriament intracellular. Es coloreja be
amb solucions alcalines de Blau de metile, pero perd aquesta propietat en
presencia de serums immunes. Precisainent aquesta fou l'observacio prfn-
ceps de SABIN, sobre la qual es fonamenta el Dye test. El Toxoplasma es
multiplica per divisio binaria longitudinal endogena (endodiogenia), for-
ma especial d'esquizogonia de la qual resulten solament dos merazoits.
Al microscopi electronic hom observa que el Toxoplasma es un orga-
nisms bastant diferenciat, en el qual hom distingeix, a part el nucli, abun-
dants mitocondries, un reticle endoplasmic, un aparell de Golgi i dife-
rents granuls i vacuoles. Esta proveit d'una doble rnembrana cellular,
Ilevat a nivell del pol anterior o afilat, on la membrana es senzilla i amb
algunes ondulacions. L'extremitat afilada s'anomena conoide, i es 1'6rgan
de penetracio; a la seva base presenta 1'anomenat per LUDYIK anell polar,
d'on surten els toxonernes, que son de 15 a 18 tubs als quals hom atribueix
una funcio digestiva i secretoria. L'anell polar es format per la conjuncio
de les dues membranes cel•lulars i per una capa de petites fibres submem-
branoses amb capacitat contractil. La funcio de moltes d'aquestes estruc-
tures es desconeix, pero nosaltres en fem mencio per posar de manifest
que el Toxoplasma es un complex mosaic antigenic que cal coneixer per
a comprendre el significat i la correlacio entre les diferents reaccions im-
munologiques, que depenen de la natura i de la qualitat de 1'antigen que
s'utilitzi, es a dir, de la seva preparac16 i de la seva puresa.
Interessa, per tant, de comparar les proves mes utilitzades, mes espe-
cffiques i sensibles i amb les quals hem treballat. Son la reaccio de frxacio
del complement, la reaccio de Sabin i Feldman, l'hemaglutinacio i la
immunofluorescencia.
La desviacid del complement de Bordet i Gengou ha estat aplicada
al Toxoplasma per la majoria dels serolegs especialitzats. Gairebe podrfem
dir que hi ha tants antigens com serolegs. L'antigen es una suspensio de
toxo plasrnes de la soca Rh, procedents del cervell del conill, de la mem-
brana corioalantoidea de l'ernbr16 de pollet o de 1'exsudat peritoneal del
ratoli. La suspensio es tractada amb formol, o mes sovint s'utilitzen els
estromes del parasit lisat amb aigua amb l'ajuda o sense 1'ajuda d'ultra-
sons, i sotmesos a congelacions repetides. Es un antigen soluble amb aigua.
La reaccio de Sabin i Feldman consisteix en l'aplicacio del fenomen
de Pfeiffer al Toxoplasma. La lisi del parasit pels anticossos especifics es
evident, si s'observa directament al microscopi de contrast de fases, o al
microscopi normal perque no s'acoloreix amb solucions alcalines de blau
de metile per les quals normalment to molta avidesa. L'antigen es 1'exsu-
dat peritoneal del ratoli inoculat 48 hores abans. 1!.s un antigen de super-
ficie insoluble, pero el liquid ascftic pot contenir antigen soluble i pot
92
FIGS. 1, 2 i :;.
I o\opla,mc, N i [is
,()Itilli dc Ics (i.1-
Illics dc 1,CNsudat
pciii(mc^11 dcl 1:1
I(di (I. M c'I I c.
dc i (),il
X 1 2")).
A10DIFICACIONS A LA TECVICA D'IA1A1UJ'OFLUORLSCLVCIA 5
esser anticomplementari. La prova depen principalment de l'activitat del
factor accessori o complement, pero es absolutanient especffica, i des de
la reunio de Roma de l'any 1953 constitueix la prova standard. El titol
de la reaccio es la mes alta dilucio de serum a la qual el 50 °Jo o mes dels
toxoplasmes no s'han acolorit o es veuen lisats.
Els inconvenients de la reaccio de Sabin i Feldman, com son l'entrete-
niment d'una soca perillosa i la dificultat a aconseguir un bon factor
accessori, entre d'altres, portaren JACOBS i LUNDE, 1'any 1957, a aplicar al
Toxoplasma la reaccio d'hemaglutinacid de Middlebrook i Dubos, que
es basa en el fet que els eritrdcits sensibilitzats amb un antigen, s'agluti-
nen si hi ha presents anticossos especifics. La lectt)ra es sen-zilla. L'antigen
pot conservar-se liofilitzat i, per taut, no es perillos; s'obte lisant amb
aigua els toxoplasmes de 1'exsudat peritoneal del ratolf i per mitja de con-
gelacions i descongelacions repetides, la qual cosa evoca el seu origen
protoplasmatic. Es, doncs, un antigen proteic i soluble amb aigua.
Amb les mateixes intencions que JACOBS i LUNDE i tambe 1'any 1957,
GOLDMAN aplica al Toxoplasma la immunofluorescencia ideada per COONS.
Podem distingir dues varietats fonamentals: el 'blocking-test)) de Gold-
man i la prova indirecta o ((sandwich)) de Fletchner (any 1962). En aques-
ta la fixacio dels anticossos presents en el serum problema, al toxoplasma,
es manifesta a la Hum ultraviolada, per mitja d'un serum antiglobulina
humana marcat amb una substancia fluorescent. En el ((blocking-test)) el
serum marcat en comptes d'un serum de Coombs es un serum antitoxo-
plasma. Una de les dificultats mes importants de la tecnica es la presencia
de fluorescencies inespecifiques que poden esser degudes a la mateixa
natura de 1'antigen, espontaniament brillant en alguns casos, o a la utilit-
zacio d'un serum marcat insuficientnlent purificat.
Per tal de corregir l'autofluorescencia de certes preparacions hom ha
proposa la utilitzacio de filtres especials. Aquesta solucio no es del tot
satisfactoria, ja que ofereix possibilitats molt limitades, ates el petit nom-
bre de filtres utilitzables a la practica.
A fi de disininuir la inespecificitat del conjugat horn ha procurat de
purificar al maxim el serum marcat -sigui per dialisi, per cromatografia
amb gel de dextra o per adsorcio-. D'altra banda, el serum de Coombs
ha de tenir on tftol molt elevat, car s'utilitza molt dilu'ft.
Per aquestes raons nosaltres hem assajat un sistema emprat per Goi.D-
MAN en l'amebfasi, i NicuoL.s i MACCOMB en el tracoma. Consisteix a
practicar, despres de la fixacio del serum de Coombs, una contracoloracio
amb una solucio de blau d'Evans a l'1 per loooo durant 1o minuts. Els
resultats amb la contracoloracio son extremament nets, car s'eliminen totes
Les fluorescencies inespecifiques. En les reaccions positives els toxoplasmes
presenten a la periferia una Clara fluorescencia groc-verdosa, i la part cen-
93
6 JOAN RIESTRE I ESPINACH
tral, mes rogenca i fosca. En les reaccions negatives els protozous, com els
leucocits i d'altres cellules de 1'exsudat es manifesten uniformement aco-
lorits d'un roig fosc.
La tecnica indirecta aixf modificada es molt sensible i substitueix sa-
tisfactoriament el Dye test de Sabin i Feldman, car els resultats anib les
dues proves son concordants.
Es tracta d'un antigen de superffcie, insoluble a 1'aigua, resistent a
1'acetona o al metanol que s'utilitza per a fixar; esta completament des-
posseit del liquid ascftic del ratoli que pot contenir antigen soluble.
Resumint, en la reaccio de Sabin i Feldman i en la irnununofluorescen-
cia l'antigen es de superficie o membrana, insoluble amb aigua. Anrbdues
proves son mes especffiques i sensibles que les que utilitzen antigens solu-
bles amb aigua i rics en substancies proteiques intracel•lulars com son la
desviacio del complement i 1'hemaglutinacio.
D'altra banda, cis anticossos detectats amb el Dye test o la immuno-
fluorescencia apareixen cap al final de la segona setmana de la malaltia
o infeccio, mentre que els detectats per la desviacio del complement o l'he-
maglutinacio ho fan una setmana flies tard, possiblement perque 1'autigen
proteic procedent del soma dels toxoplasmes no apareix en 1'hoste en
quantitat convenient per a estirnular la formacii, d'anticossos fins que el
nornbre de toxoplasmes lisats es quantitativament important. Per ultim,
el let que els titols obtinguts amb les proves d'immunofluorescencia i de
Sabin i Feldman siguin per un mateix serum, mcs alts que els obtinguts
am[) altres proves fa que constitueixin les tecniques d'eleccio.
Totes les modificacions de Ics tecniques de preparacio d'antfgens,
orientades a aconseguir un augment de la sensibilitat de les reaccions,
corn, per exemple, les modificacions de DI:S1roN'rs a la D. del C., i les
d'ENGELIIREICHT a l'hemaglutinacio, van acornpany°ades d'una perdua im-
portant d'especificitat.
Per a nosaltres, algunes recaigudes serologiques o cicatrius serolo(yi-
ques, i rnoltes discrepancies entre diferents tecniques aplicades al mateix
serum, no son sing la consequencia d'utilitzar antigens impurs, poc con-
trolats o defectuosos, cs a dir, hi ha ocasions en que les diferencies no
son en els serums, sino en les tecniques.
Una giiestio interessant es el significat dels titols. Quan els resultats son
negatius, o quan son positius a titols alts (iguals o superiors a 1'r ` 1024)
la interpretacio no ofereix problemes, pero quan el titol es relativainent
baix i pot tractar-se d'un focus toxoplasmic molt aillat o delimitat o d'un
focus secundari, la interpretacio es fa mes diffcil. Afortunadament aques-
tes situations no son les rues corrents. Naturalinent, el significat dun tftol
tambe depen del moment que es faci la determinacio. Un tftol baix, per
exemple a 1'i/64 o a 1'1/256, pot esser un tftol residual sense relacio amb
94
MODIFICACIONS A LA TECNICA D'IMMUNOFLUORESCENCL4 7
el proces actual del pacient, o pot esser un titol que augmenta per trac-
tar-se d'una infeccio recent. Per a interpretar tin titol, doncs, no solament
son indispensables les dades cliniqucs, sing que de vegades cal repetir la
titulacio al cap d'uns quants dies per observar la possible variacio del
resultat, perque, atesa ]a prolongada persistcncia dels anticossos en el
scrum, una determinacio unica no es suficient per a inforniar-nos sobre
l'aetivitat o l'antiguitat de la infeccio.
D'altra banda, el titol i el temps necessari per a arribar a 1'acme de
la corba d'anticossos es independent de la gravetat del proces, i tambe
varia segons la virulencia de la soca, lloc i quantitat de la inoculacio i
segons la resposta de 1'hoste. Nosaltres hem observat els titols mes alts en
les formes ganglionars i hepatiques.
Per ultim, unes dades estadistiques de la nostra casuistica. En el nos-
tre ambient, entre la poblacio de trenta anys la iufestacio es del 8o %. La
incidencia de la infeccio to dos maxims: un a la primera infancia, i l'altre,
dels 15 als 3o anys, es a dir, 1'epoca que la dona esdeve mare.
Hom distingeix una forma de toxoplasmosi congcnita, cs it dir, adqui-
rida pel fetus abans del naixement, i una forma propiament adquirida.
Segons DESMONTS, un 8 °/oo de les dunes adquireixen la toxoplasmosi du-
rant l'embaras, i en la meitat dels casos la transmeten al fill. Sortosament,
la majoria dels non nats presenten formes inaparents o benignes. La mes
sovint diagnosticada es la coriorretinitis, i es quasi patognomonic el focus
en roseta paramacular, d'uveitis granulomatosa descrit per FRANcols.
De les formes adquirides, la ganglionar afectant un sol gangli o grup
ganglionar (en general cervicals) es la mes frequent. Te tambe interes l'en-
dometritis toxoplasmica pel fet d'esser causa frequent d'avortainents repe-
tits i de naixements prematurs.
95


Modificacions a la tècnica d'immunofluorescència aplicada al toxoplasma i resultats

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Revistes Catalanes amb Accés Obert