Polymerase chain reaction (PCR) based on oligonucleotide primers targeting the mitochondrial 12S rRNA gene has been applied to the specific identification of meats from quail (Coturnix coturnix), pheasant (Phasianus colchicus), partridge (Alectoris spp), and guinea fowl (Numida meleagris)

González Alonso, I.

Martín de Santos, R.

Rojas Diéguez, M.

Portal de Revistas Científicas Complutenses

ISSN: 1988-2688
RCCV Vol. 2 (2). 2008
AUTENTIFICACIÓN DE CARNE Y PRODUCTOS CÁRNICOS PROCEDENTES DE 
CODORNIZ, FAISÁN, PERDIZ Y PINTADA MEDIANTE UNA TÉCNICA DE PCR 
CON CEBADORES ESPECIE-ESPECÍFICOS 
AUTHENTICATION OF MEATS AND MEAT PRODUCTS FROM QUAIL, 
PHEASANT, PARTRIDGE AND GUINEA FOWL BY SPECIES-SPECIFIC PCR 
M. Rojas Diéguez, I. González Alonso y R. Martín de Santos 
Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos. Facultad de 
Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid 
Resumen 
 En este trabajo se ha desarrollado una técnica de PCR (Reacción en Cadena de la 
Polimerasa) empleando cebadores especie-específicos diseñados en el gen mitocondrial 12S 
ARNr, para la autentificación de carne y productos cárnicos procedentes de codorniz (Coturnix 
coturnix), faisán (Phasianus colchicus), perdiz (Alectoris spp) y pintada (Numida meleagris). 
Palabras clave: aves de caza, 12S ARNr, reacción en cadena de la polimerasa, cebadores 
especie-específicos. 
Abstract 
 Polymerase chain reaction (PCR) based on oligonucleotide primers targeting the 
mitochondrial 12S rRNA gene has been applied to the specific identification of meats from quail 
(Coturnix coturnix), pheasant (Phasianus colchicus), partridge (Alectoris spp), and guinea fowl 
(Numida meleagris).  
Key words: game birds, 12S rRNA gene, polymerase chain reaction (PCR), species-
specific primers. 
Introducción 
 En España, el consumo de carne procedente de las aves de caza ha aumentado de forma 
notable en los últimos años. Asimismo, cada vez son más numerosas las explotaciones dedicadas 
a la producción intensiva de codorniz, faisán, perdiz y pintada en lo que se conoce como 
avicultura alternativa (MAPA, 2004). El aumento en el consumo de carne procedente de estas 
especies, justifica la necesidad de prestar una mayor atención a la adecuada autentificación de las 
mismas, sobre todo en productos picados, deshuesados, escabechados, patés, etc., donde 
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desaparecen las características morfológicas que facilitan su identificación. La autentificación es 
necesaria para evitar prácticas fraudulentas derivadas de la sustitución de las especies más 
valoradas por aquéllas de menor valor comercial y organoléptico (Partis et al., 2000).  
 En la actualidad, las técnicas genéticas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa 
(PCR) constituyen una de las alternativas más específicas para llevar a cabo la diferenciación de 
especies animales (Lenstra et al., 2001). En consecuencia, el objetivo de este trabajo de 
investigación ha consistido en el desarrollo y aplicación de una técnica de PCR con cebadores 
especie-específicos, para la identificación y diferenciación de carnes y productos cárnicos 
procedentes de codorniz, faisán, perdiz, y pintada. 
Material y métodos 
1. Selección y extracción del ADN de muestras cárnicas 
 Se utilizaron muestras de tejido muscular procedente de codorniz, faisán, perdiz roja, 
perdiz chukar, perdiz moruna y pintada. Estas muestras se analizaron crudas y después de 
someterse a tratamientos térmicos de pasteurización (72ºC, 30 minutos) y esterilización (121ºC, 
20 minutos). Asimismo, se elaboraron mezclas cárnicas binarias que contenían un 0,1, 1, 5, 10 y 
25% de tejido muscular de cada especie diana en una matriz de tejido muscular de pollo. Las 
mezclas binarias se analizaron crudas y tras someterse a un tratamiento térmico de esterilización 
(121 ºC, 20 min). Para determinar la especificidad de los cebadores se emplearon muestras de 
tejido muscular procedente de varias especies de aves y mamíferos. En este trabajo se analizaron 
patés, productos picados, escabechados y estofados de codorniz, faisán, perdiz, y pintada. 
 El ADN de las muestras analizadas se extrajo utilizando el kit comercial Wizard® DNA 
Clean-up de Promega, de acuerdo al método descrito por Rodríguez et al. (2003). 
2. Selección de marcadores genéticos y amplificación por PCR 
 El marcador genético empleado en este trabajo ha sido el gen mitocondrial 12S ARN 
ribosómico. A partir de las secuencias de este gen disponibles en la base de datos NCBI (National 
Center for Biotechnology Information) se diseñó la pareja de cebadores 12SEQDIR-12SEQINV 
que delimitan un fragmento conservado de aproximadamente 720 pb en todas las especies 
analizadas.  
 Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron en un volumen total de 25 µL, con 
5 pm de cada cebador y 100 ng de ADN. La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo 
en un termociclador programado para realizar una desnaturalización inicial del ADN a 93ºC 
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durante 2 min, seguida de 40 ciclos que comprendían las siguientes etapas: 30 s a 93ºC, 30 s a 
65ºC y 45 s a 72ºC. La última extensión se prolongó durante 5 min.  
 La purificación de los productos de PCR amplificados se realizó utilizando el kit de 
extracción QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). La secuenciación de los productos de PCR 
purificados fue llevada a cabo por Sistemas Genómicos S.L. (Parque Tecnológico de Valencia, 
España). 
 La alineación y el análisis informático de las secuencias nucleotídicas del fragmento 
amplificado por los cebadores 12SEQDIR-12SEQINV permitió el diseño de cuatro parejas de 
cebadores en zonas de la región mitocondrial del gen 12S ARNr: 12SCODIR-12SCOINV, 
12SFAISDIR-12SFAISINV, 12SPERDIR-12SPERINV y 12SPINTDIR-12SPINTINV. Estos 
cebadores se emplearon en una técnica de PCR para la amplificación de fragmentos específicos a 
partir del ADN extraído del tejido muscular procedente de codorniz, faisán, perdiz y pintada. 
Como control positivo de amplificación se diseñó la pareja de cebadores conservados 
18SEUDIR-18SEUINV a partir de secuencias del gen 18S ARNr disponibles en la base de datos 
NCBI para varias especies de aves y mamíferos. Estos cebadores delimitan un fragmento de 89 
pares de bases en todas las especies analizadas. 
Resultados y discusión 
 La práctica totalidad de los estudios realizados en la identificación genética de especies 
animales hacen referencia a especies domésticas como la vaca, oveja, cabra, cerdo y pollo, siendo 
prácticamente inexistentes los estudios efectuados para la diferenciación de carnes y productos 
cárnicos procedentes de aves de caza y de la avicultura alternativa (Rodríguez et al., 2003; Lahiff 
et al., 2001; Girish et al., 2005). En este trabajo de investigación se ha empleado una técnica de 
PCR con cebadores especie-específicos diseñados en el gen mitocondrial 12S ARNr, para la 
identificación de carnes y productos cárnicos procedentes de codorniz, faisán, perdiz, y pintada.  
 El estudio informático de las secuencias de la región 12S ARNr disponibles en la base de 
datos NCBI, permitió el diseño de la pareja de cebadores conservados 12SEQDIR-12SEQINV. 
Estos cebadores amplificaron un fragmento de ADN de aproximadamente 720 pb en todas las 
especies seleccionadas en este estudio. Tras la secuenciación y el análisis de los fragmentos 
amplificados de la región 12S ARNr en varios individuos de cada especie, se diseñaron cuatro 
parejas de cebadores para la identificación específica de codorniz, faisán, perdiz y pintada. Los 
cebadores específicos de codorniz amplificaron un fragmento específico de 129 pb del gen 
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mitocondrial 12S ARNr. De forma similar, los cebadores específicos de faisán, perdiz y pintada, 
amplificaron fragmentos de 113, 141 y 139 pb respectivamente. Esta amplificación se produjo 
tanto en muestras de carne cruda, como en aquéllas sometidas a tratamientos térmicos de 72°C 
durante 30 min y de 121°C durante 20 min (Figura 1). Los cebadores específicos de perdiz 
amplificaron un fragmento de 141 pb en todas las especies de perdiz analizadas. 
La especificidad de los cebadores diseñados se determinó frente a ADNs procedentes de 
otras especies. Los cebadores permitieron la amplificación del fragmento específico únicamente 
en las muestras que contenían el ADN de la especie diana y no produjeron bandas de 
amplificación cuando se enfrentaron al ADN de otras especies animales (Tabla 1). Los cebadores 
conservados 18SEUDIR-18SEUINV amplificaron el fragmento de 89 pb del gen 18S rRNA en 
todas las especies analizadas. 
 A B C
Figura 1. Análisis electroforético de los productos de PCR del gen 12S ARNr amplificados con los
cebadores específicos de codorniz 12SCODIR-12SCOINV (A), faisán 12SFAISDIR-12SFAISINV (B),
perdiz 12SPERDIR-12PERINV (C) y pintada 12SPINTDIR-12SPINTINV (D). Muestras: muestra cruda
(1), muestra tratada a 72˚C durante 30 min (2), y muestra tratada a 121˚C durante 20 min (3). CN:
Control negativo. M: Marcador de peso molecular 1kb plus DNA ladder (GibcoBRL) 
    D
 
       M    CN    1     2     3 
129 bp 
113 bp 
141 bp
130 bp 
 
       M    CN    1     2     3 
 
    M   CN    1     2      3 
 
      M   CN    1     2     3 
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Tabla 1.- Especificidad de las parejas de cebadores diseñados para la identificación especifica de codorniz 
(12SCODIR-12SCOINV), faisán (12SFAISDIR-12SFAISINV), perdiz (12SPERDIR12SPERINV) y pintada 
(12SPINTDIR-12SPINTINV) empleando ADN de varias especies de aves y mamíferos. Los cebadores 18SEUDIR-
18SEUINV fueron empleados como control positivo de amplificación del ADN total presente en las muestras 
Nombre común Nombre en latín 12SCODIR 12SCOINV 
12SFAISDIR 
12SFAISINV 
12SPERDIR 
12SPERINV 
12SPINTDIR 
12SPINTINV 
18SEUDIR 
18SEUINV 
Codorniz Coturnix coturnix 129 pb -a - - 89 bp 
Faisán Phasianus colchicus - 113 pb - - 89 bp 
Perdiz roja Alectoris rufa - - 141 pb - 89 bp 
Perdiz chukar Alectoris chukar - - 141 pb - 89 bp 
Perdiz moruna Alectoris barbara - - 141 pb - 89 bp 
Pintada Numida meleagris - - - 130 pb 89 bp 
Urogallo Tetrao urogallus - - - - 89 bp 
Becada Scolopax rusticola - - - - 89 bp 
Paloma torcaz Columba palumbus - - - - 89 bp 
Zorzal común Turdus philomelas - - - - 89 bp 
Pollo Gallus gallus - - - - 89 bp 
Pavo Meleagris gallipavo - - - - 89 bp 
Pato de berbería Cairina moschata - - - - 89 bp 
Oca Anser anser - - - - 89 bp 
Vaca Bos taurus - - - - 89 bp 
Oveja Ovis aries - - - - 89 bp 
Cabra Capra hircus - - - - 89 bp 
Cerdo Sus scrofa dom. - - - - 89 bp 
Gamo Dama dama - - - - 89 bp 
Corzo Capreolus capreolus - - - - 89 bp 
Ciervo Cervus elaphus - - - - 89 bp 
Rebeco Rupicapra rupicapra - - - - 89 bp 
Muflón Ovis ammon - - - - 89 bp 
Cabra montés Capra pyrenaica - - - - 89 bp 
a No aparece amplificación del producto de PCR 
 El límite de detección se determinó mediante el análisis de mezclas binarias que contenían 
un 0,1, 1, 5, 10 y 25% de cada especie diana en carne de pollo. Para confirmar la ausencia de 
inhibición en la técnica de PCR desarrollada se llevaron a cabo reacciones de PCR múltiple, 
combinando cada pareja de cebadores específicos con los cebadores conservados del gen 18S. El 
límite de detección del ensayo fue del 0,1% para las cuatro especies analizadas, tanto en las 
muestras crudas (Figura 2) como en las sometidas a tratamiento térmico. 
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 En este trabajo, se analizaron diversos productos comerciales que contenían carne de 
codorniz, faisán, perdiz y pintada, obteniéndose resultados satisfactorios al emplear los cebadores 
específicos diseñados (Tabla 2).  
 
 
    M    CN   1     2     3     4     5     6      
  A 
       89 bp 
     129 bp 
 
       M    CN   1     2     3     4     5     6   
  B 
      89 bp
    113 bp
 
    M    CN   1     2     3     4     5     6      
  C 
       89 bp 
     141 bp 
 
    M    CN   1     2     3     4     5     6      
    D 
      89 bp
    130 bp
Figura 2. Análisis electroforético de los productos de PCR obtenidos de mezclas binarias crudas de:
codorniz en pollo (A), faisán en pollo (B), perdiz roja en pollo (C) y pintada en pollo (D), empleando los
cebadores 12SCODIR-12SCOINV, 12SFAISDIR-12SFAISINV, 12SPERDIR-12PERINV y
12SPINTDIR-12SPINTINV respectivamente, combinados con los cebadores 18SEUDIR-18SEUINV.
En todas las imágenes las líneas 1-6 corresponden a mezclas binarias que contienen un 0,1%, 1%, 5%,
10%, 25% y 100% de la especie diana, respectivamente. CN: Control negativo. M: Marcador de peso
molecular de 50-1000 pb ladder (Biomarker® Low, BioVentures, Inc.) 
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Resultados del análisis mediante PCR de productos cárnicos comerciales de codorniz, faisán, perdiz y pintada 
empleando los cebadores 12SCODIR-12SCOINV, 12SFAISDIR-12SFAISINV, 12SPERDIR12SPERINV, y 
12SPINTDIR-12SPINTINV. Los cebadores 18SEUDIR-18SEUINV fueron empleados como control positivo 
de amplificación del ADN total presente en las muestras 
Especie presente en la 
etiqueta Tipo de producto 
12SCODIR 
12SCOINV 
12SFAISDIR 
12SFAISINV 
12SPERDIR 
12SPERINV 
12SPINTDIR 
12SPINTINV 
18SEUDIR 
18SEUINV 
Codorniz Carne estofada 129 pb -a - - 89 bp 
Codorniz Carne escabechada 129 pb - - - 89 bp 
Codorniz Carne deshuesada 129 pb - - - 89 bp 
Codorniz Carne picada 129 pb - - - 89 bp 
Codorniz Paté A 129 pb - - - 89 bp 
Codorniz Paté B 129 pb - - - 89 bp 
Faisán Carne estofada - 113 pb - - 89 bp 
Faisán Paté A - 113 pb - - 89 bp 
Faisán Paté B - 113 pb - - 89 bp 
Faisán Paté C - 113 pb - - 89 bp 
Faisán Paté D - 113 pb - - 89 bp 
Faisán Paté E - 113 pb - - 89 bp 
Perdiz Carne estofada - - 141 pb - 89 bp 
Perdiz Carne escabechada A - - 141 pb - 89 bp 
Perdiz Carne escabechada B - - 141 pb - 89 bp 
Perdiz Carne escabechada C - - 141 pb - 89 bp 
Perdiz Carne deshuesada - - 141 pb - 89 bp 
Perdiz Paté A - - 141 pb - 89 bp 
Perdiz Paté B - - 141 pb - 89 bp 
Perdiz Paté C - - 141 pb - 89 bp 
Perdiz Paté D - - 141 pb - 89 bp 
Pintada Carne estofada - - - 130 pb 89 bp 
Pintada Carne picada - - - 130 pb 89 bp 
Pintada Paté A - - - 130 pb 89 bp 
   a No aparece amplificación del producto de PCR 
Conclusión 
 Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que la técnica de PCR desarrollada 
con cebadores especie-específicos, permite llevar a cabo la autentificación y trazabilidad de 
carnes y productos cárnicos procedentes de codorniz, faisán, perdiz y pintada de una forma 
rápida, sencilla y eficaz. 
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Agradecimientos 
Este trabajo ha sido financiado por la Dirección General de Universidades de la Comunidad 
de Madrid (Programa de Vigilancia Sanitaria S-0505/AGR/000265) y por el Ministerio de 
Educación y Ciencia de España (proyecto AGL 2007-60077). María Rojas disfruta de una beca 
del Ministerio de Educación y Ciencia.  
Bibliografía 
Girish, PS, Anjaneyulu, ASR, Viswas, KN, Shivakumar, BM, Anand, M, Patel, M y 
Sharma, B. 2005. Meat species identification by polymerase chain reaction-restriction fragment 
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Lahiff, S, Glennon, M, O´Brien, L, Lyng, J, Smith, T, Maher, M y Shilton, N. 2001. 
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Swine in Foie Gras by Species-Specific Polymerase Chain Reaction. J. Agric. Food Chem., 
51:1524-1529. 
 
206


Autentificación de carne y productos cárnicos procedentes de codorniz, faisán, perdiz y pintada mediante una técnica de PCR con cebadores especie-específicos

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