Se ha desarrollado una técnica de PCR para la detección de Alternaria spp. En productos hortofrutícolas, empleando cebadores que amplifican un fragmento de 195 pb del gen Alt a 1. El límite de detección de la técnica desarrollada fue de 102 ufc/ml, tanto en medio de cultivo como en pulpa de tomate.A polymerase chain reaction (PCR) method, based on oligonucleotide primers targeting the Alt a 1 gene, has been developed for the specific identification of Alternaria spp. In vegetables. The limit of detection of the method was 102 cfu/ml either in culture or tomato paste

García Lacarra, T.

Martín de Santos, R.

Pavón Moreno, M. A.

Portal de Revistas Científicas Complutenses

ISSN: 1988-2688
RCCV Vol. 2 (2). 2008
 
UTILIZACIÓN DEL GEN Alt a 1 PARA LA DETECCIÓN DE Alternaria spp. EN 
PRODUCTOS HORTOFRUTÍCOLAS MEDIANTE UNA TÉCNICA DE PCR 
PCR DETECTION OF Alternaria spp. IN VEGETABLE PRODUCTS BASED ON 
THE GENETIC MARKER Alt a 1 
M. A. Pavón Moreno, T. García Lacarra y R. Martín de Santos 
Departamento de  Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Facultad de 
Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid 
Resumen 
Se ha desarrollado una técnica de PCR para la detección de Alternaria spp. en 
productos hortofrutícolas, empleando cebadores que amplifican un fragmento de 195 pb del 
gen Alt a 1. El límite de detección de la técnica desarrollada fue de 102 ufc/ml, tanto en 
medio de cultivo como en pulpa de tomate. 
Palabras clave: reacción en cadena de la polimerasa (PCR), Alternaria spp., Alt a 1 
Abstract 
 A polymerase chain reaction (PCR) method, based on oligonucleotide primers targeting 
the Alt a 1 gene, has been developed for the specific identification of Alternaria spp. in 
vegetables. The limit of detection of the method was 102 cfu/ml either in culture or tomato 
paste. 
Key words: polymerase chain reaction (PCR), Alternaria spp., Alt a 1 
Introducción 
Alternaria es un género fúngico muy común y ampliamente distribuido en el suelo, la 
materia orgánica en descomposición y el polvo doméstico (King y Schade, 1984). Incluye 
numerosas especies que pueden invadir los cultivos vegetales antes y después de la 
recolección. Asimismo, se les considera responsables de cuantiosas pérdidas económicas en 
el sector agrícola. Algunas especies de Alternaria son específicas de determinados cultivos 
mientras que otras, como Alternaria alternata, afectan a gran variedad de vegetales. A. 
alternata se aísla con mucha frecuencia de frutas y hortalizas frescas, en las que produce 
deterioro durante el transporte, manipulación y almacenamiento post-cosecha incluso a bajas 
temperaturas. También se ha aislado de cereales y oleaginosas cuando el secado de los 
granos en el campo se demora por la lluvia, lo que conlleva niveles de humedad elevada. 
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Se han identificado más de 60 especies en el género Alternaria, muchas de las cuales 
producen metabolitos tóxicos para los mamíferos y aves (micotoxinas) y/o para las plantas 
(fitotoxinas) (Minoletti et al., 2002). La principal especie productora de micotoxinas es A. 
alternata, que produce ácido tenuazónico, alternariol (AOH), alternariol metil eter (AME), 
altenueno, altertoxina-I y toxinas AAL (Bottalico y Logrieco, 1998). Las toxinas de 
Alternaria son responsables de varias enfermedades que afectan al hombre y a los animales. 
El consumo de maíz contaminado con A. alternata se ha asociado con una elevada 
incidencia de cáncer de esófago en determinadas zonas geográficas (Liu et al,, 1991, 1992). 
Además, se ha demostrado que los extractos de A. alternata tienen efecto citotóxico y 
actividad mutagénica en microorganismos y en células de mamíferos (Lehman et al., 2006). 
La frecuente contaminación con A. alternata de algunos productos hortofrutícolas 
como tomates, peras, cítricos y sus derivados (zumos, néctares, compotas, purés, ketchup, 
etc.) es objeto de especial preocupación por la repercusión que la presencia continuada de 
micotoxinas como AOH y AME puede tener a largo plazo en la salud de los consumidores. 
Teniendo en cuenta que Alternaria spp. sintetiza múltiples micotoxinas, la detección de cada 
una de ellas no resulta práctico ni realista, puesto que el elevado coste económico resultaría 
inviable.  
Una alternativa que permitiría estimar de una forma indirecta la posible presencia de 
micotoxinas en materias primas o productos elaborados consiste en la detección y 
enumeración rápida de las especies de Alternaria en estas matrices. Disponer de técnicas 
rápidas y específicas con este fin permitiría a las industrias elaboradoras establecer un 
control adecuado de sus proveedores, mejorar la trazabilidad de los productos 
hortofrutícolas y eliminar de los canales de comercialización los lotes que puedan 
representar un peligro para la salud del consumidor. El objetivo de este trabajo ha consistido 
en el desarrollo de una técnica genética basada en la reacción en cadena de la polimerasa 
(PCR) para la detección y enumeración rápida de Alternaria spp. en productos 
hortofrutícolas. 
Material y métodos 
Selección y obtención de cepas fúngicas. 
Se seleccionaron trece cepas de Alternaria spp. productoras de micotoxinas, 
correspondientes a 11 especies de este género (colección de cepas fúngicas Centraalbureau 
voor Schimmelcultures, CBS, Holanda). Asimismo, se adquirieron cepas fúngicas 
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pertenecientes a varios géneros y especies en la Colección Española de Cultivos Tipo 
(CECT, Valencia). Las cepas seleccionadas se cultivaron en Agar Patata Dextrosa (PDA) y 
en Agar Extracto de Malta (MEA) a 25 ºC durante 7 días. 
Extracción del ADN.  
La extracción del ADN de los mohos a partir de cultivos puros y de alimentos se 
realizó según el método descrito por Marek et al. (2003). La concentración y calidad del 
ADN obtenido se determinó espectrofotométricamente y su integridad se evaluó por 
electroforesis en gel de agarosa de 1%. 
Diseño de cebadores y amplificación por PCR. 
Los cebadores Dir3Alta1 (5’-CGAGGGTGACTACGTCTGGAAG-3’) e Inv4Alta1 
(5’-CGCGGCAGTAGTTGGGAA-3’) se diseñaron a partir de la alineación y análisis 
informático de las secuencias del gen Alt a 1 disponibles en la base de datos GenBank. Estos 
cebadores delimitan una región de 350 pb del citado gen en todas las especies de Alternaria. 
Asimismo, la comparación de las secuencias del fragmento amplificado con los cebadores 
Dir3Alta1/Inv4Alta1 en las especies de Alternaria se empleó para diseñar el cebador 
Dir5cAlta1 (5’-GAGAACAGCTTCATGGACTTCTCTTT-3’) que, combinado con el 
Inv4Alta1, delimita un fragmento de 195 pb del gen Alt a 1.  
La especificidad de las parejas de cebadores Dir3Alta1/Inv4Alta1 y 
Dir5cAlta1/Inv4Alta1 se determinó mediante el análisis del ADN extraído a partir de once 
especies del género Alternaria y de diversas especies de hongos, bacterias, plantas y 
animales. 
Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron en un volumen total de 25 µL, 
con 10 pmoles de cada cebador y 10 ng de ADN. La reacción de PCR se llevó a cabo en un 
termociclador programado para realizar una desnaturalización inicial del ADN a 93ºC 
durante 2 min, seguida de 35 ciclos que comprendían las siguientes etapas: 30 s a 93ºC, 30 s 
a 55ºC y 45 s a 72ºC. La última extensión se prolongó durante 5 min.  
Límite de detección 
El límite de detección y la influencia de los tratamientos térmicos en la capacidad del 
método para detectar Alternaria spp. se evaluaron mediante el análisis, en paralelo, de 
diluciones decimales de un cultivo de A. alternata fresco y del mismo cultivo sometido a 
tratamientos térmicos de 60 ºC durante 30 min y 90 ºC durante 5 min. La influencia de una 
matriz vegetal en la sensibilidad de la técnica de PCR se evaluó mediante el análisis de 
muestras de pulpa de tomate inoculadas con diluciones de un cultivo viable de A. alternata. 
 
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Resultados y discusión 
Para la detección específica de Alternaria spp. se deben seleccionar marcadores 
génicos con un grado de variabilidad interespecífica adecuada. En este trabajo se seleccionó 
el gen Alt a 1 porque codifica el principal alergeno de A. alternata y de otras especies de 
este género (Abebe et al., 2006).  
Los cebadores Dir3Alta1/Inv4Alta1 y Dir5Alta1/Inv4Alta1 amplificaron un fragmento 
de  350 pb y 195 pb, respectivamente, en todas las especies de Alternaria analizadas, sin que 
se produjera amplificación del ADN procedente de otros hongos, bacterias, plantas o 
animales (Figuras 1 y 2). El fragmento amplificado por los cebadores Dir5cAlta1/Inv4Alta1 
presenta una intensidad homogénea en las distintas especies de Alternaria y, debido a su 
menor tamaño, es más adecuado para el análisis de productos tratados térmicamente que el 
delimitado por los cebadores Dir3Alta1/Inv4Alta1, en los que puede existir cierta 
degradación del ADN fúngico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FIGURA 1. Análisis electroforético de los productos de PCR del marcador génico Alt a 1 
obtenidos con los cebadores Dir3Alta1/Inv4Alta1. (A) Amplificación a partir de especies de 
Alternaria: A. alternata (1-3), A. tennusima (4), A. gaisen (5), A. dauci (6), A. infectoria (7), A. 
longipes (8), A. citri  (9), A. radicina 10), A. porri  (11), A. solani (12), A. arborescens (13). (B) 
Amplificación a partir de otros organismos: A. alternata (1), Rhizopus stolonifer (2), Penicillium 
expansum (3), Fusarium oxysporum (4), Aspergillus alutaceus (5), Saccharomyces cerevisiae (6), 
Escherichia coli (7), Cacahuete (8), Nuez (9), Cabra (10),  Merluza (11) y  Pollo (12). (C-) Control 
negativo sin ADN, (M) Marcador de tamaño molecular 1 Kb plus DNA ladder. 
 
 
 
 
M  C-    1    2    3    4   5    6   7    8   9  10  11  12 13   M  C-    1    2     3    4   5    6    7    8   9  10  11   12 
350 pb 
350 pb 
A B 
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FIGURA 2. Análisis electroforético de los productos de PCR del marcador génico Alt a 1 
obtenidos con los cebadores Dir5cAlta1/Inv4Alta1. (A) Amplificación a partir de especies de 
Alternaria: A. alternata (1-3), A. tennusima (4), A. gaisen (5), A. dauci (6), A. infectoria (7), A. 
longipes (8), A. citri  (9), A. radicina 10), A. porri  (11), A. solani (12), A. arborescens (13). (B) 
Amplificación a partir de otros organismos: A. alternata (1), Rhizopus stolonifer (2), Penicillium 
expansum (3), Fusarium oxysporum (4), Aspergillus alutaceus (5), Saccharomyces cerevisiae (6), 
Escherichia coli (7), Cacahuete (8), Nuez (9), Cabra (10),  Merluza (11) y  Pollo (13). (C-) Control 
negativo sin ADN, (M) Marcador de tamaño molecular 1 Kb plus DNA ladder. 
 
Conviene señalar  que cuando se analizaron algunas muestras de arroz, girasol y 
salvado de trigo se amplificó una banda del mismo tamaño que la de Alternaria spp., lo que 
podría indicar una contaminación de la materia prima de la que se había extraído el ADN 
con alguna especie de este género (Figura 3). Para comprobar esta hipótesis, se purificaron y 
secuenciaron las bandas de amplificación obtenidas a partir del ADN de arroz, girasol y 
salvado de trigo. Las secuencias obtenidas se compararon con la base de datos GenBank, 
utilizando el programa BLAST del paquete informático NCBI. Se encontró una coincidencia 
del 99,5% entre la secuencia de la muestra de trigo y la secuencia de Alternaria infectoria. 
Asimismo, se obtuvo una coincidencia del 100% entre las secuencias de las bandas 
amplificadas en las muestras de arroz y girasol y la de A. alternata. Sin embargo, no se 
encontró homología entre las secuencias analizadas y las secuencias de especies vegetales, 
lo que permitió concluir que los cebadores diseñados son específicos del género Alternaria y 
no amplifican el ADN de animales, plantas, levaduras ni bacterias.  
 
 
 
M  C-    1    2    3    4   5    6   7    8   9  10  11  12 13  M  C-    1    2    3    4   5    6   7    8   9  10  11  12 13  
195 pb 195 pb 
A B 
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FIGURA 3. Análisis electroforético de los productos de PCR del marcador génico Alt a 1 
obtenidos con los cebadores Dir3Alta1/Inv4Alta1. Amplificación a partir de A. alternata (1), Avena 
(2), Soja (3), Cacahuete (4), Pistacho (5), Avellana (6), Almendra (7), Nuez (8), Piñón (9), Arroz 
(10), Girasol (11) y Salvado de trigo (12). (C-) Control negativo sin ADN, (M) Marcador de tamaño 
molecular 1 Kb plus DNA ladder. 
 
El límite de detección de la técnica fue de de 0,01 ng de ADN de A. alternata (Figura 
4) y de 102 ufc/ml tanto en el cultivo viable como en los inactivados por calor a 60 o 90 ºC 
(Figura 5)  y en pulpa de tomate (Figura 6). 
 
 
FIGURA 4. Análisis electroforético de los productos de PCR del marcador génico Alt a 1 obtenidos 
con los cebadores Dir5cAlta1/Inv4Alta1a partir de diluciones decimales del ADN extraido de un 
cultivo de A. alternata CBS 117143: 10 ng (1), 1 ng (2), 0,1 ng (3), 0,01 ng (4), 0,001 ng (5). (C-) 
Control negativo sin ADN, (M) Marcador de tamaño molecular 1 Kb plus DNA ladder. 
 
 
350 pb 
M    C-    1     2    3     4     5    6     7     8   9   10   11   12   
M          C-               1         2             3           4          5
195 pb 
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FIGURA 5. Análisis electroforético de los productos de PCR del marcador génico Alt a 1 obtenidos 
con los cebadores Dir5cAlta1/Inv4Alta1a partir de diluciones decimales de un cultivo de A. alternata 
CBS 117143  sometido a distintos tratamientos térmicos. (A) Cultivo fresco viable. (B) Cultivo tratado 
a 60ºC/30 min. (C) Cultivo tratado a 90 ºC/5 min. El recuento de A. alternata antes del tratamiento 
térmico corresponde a 2,5 x 105 ufc/ml (1), 2,5 x 104 ufc/ml (2), 2,5 x 103 ufc/ml (3), 2,5 x 102 ufc/ml 
(4), 2,5 x 101 ufc/ml (5) y 2,5 ufc/ml (6). (C-) Control negativo sin ADN, (C+) Control positivo con 
ADN de 2,5 x 105 ufc/ml viables.  (M) Marcador de tamaño molecular 1 Kb plus DNA ladder. 
195 195 
195 
M     C-      1      2      3      4   M     C-      1      2      3      4   M     C-      1      2      3      4   
A B C
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   C-      C+          1         2         3        4        5        6        7    
       195 pb 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FIGURA 6. Análisis electroforético de los productos de PCR del marcador génico Alt a 1 
obtenidos con los cebadores Dir5cAlta1/Inv4Alta1 a partir de pulpa de tomate contaminada con 
diluciones de un cultivo fresco de A. alternata CBS 117143.  Los recuentos de A. alternata en las 
muestras fueron de 1,6 x 105 ufc/ml (1), 3,5 x 104 ufc/ml (2), 5,5 x 103 ufc/ml (3),7 x 102 ufc/ml (4), 
3,5 x 102 ufc/ml (5), 102 ufc/ml (6), Tomate sin contaminar y con recuento de 0 ufc/ml (7). (C-) 
Control negativo sin ADN, (C+) Control positivo con ADN de 2,5 x 105 ufc/ml viables. 
 
Conclusión 
Los resultados obtenidos en este trabajo han puesto de manifiesto que la técnica de 
PCR desarrollada es rápida, específica y sensible para la detección de bajas concentraciones 
de especies de Alternaria spp. con un límite de detección de 102 ufc/ml tanto en cultivo 
fresco y tratado térmicamente, como en muestras de alimentos. En consecuencia, se trata de 
una técnica que podría emplearse como marcador de calidad y bioseguridad de materias 
primas y productos elaborados en las industrias de transformación de vegetales.  
Agradecimientos 
Este trabajo ha sido financiado por la Dirección General de Universidades de la 
Comunidad de Madrid (Programa de Vigilancia Sanitaria S-0505/AGR/000265) y el 
Ministerio de Educación y Ciencia (proyecto AGL 2006-07659). Miguel Ángel Pavón 
disfruta una Beca Predoctoral del Ministerio de Educación y Ciencia. 
 
 
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Utilización del gen Alt a 1 para la detección de Alternaria spp. en productos hortofrutícolas mediante una técnica de PCR

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Utilización del gen Alt a 1 para la detección de Alternaria spp. en productos hortofrutícolas mediante una técnica de PCR

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