Study of Photodynamic therapy combined with antioxidants in prostate cancer cells

Abstract

135 σ.Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο--Μεταπτυχιακή Εργασία. Διεπιστημονικό-Διατμηματικό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών (Δ.Π.Μ.Σ.) “Μικροσυστήματα και Νανοδιατάξεις”Η Φωτοδυναμική Θεραπεία(ΦΔΘ) είναι μια πολλά υποσχόμενη μέθοδος αντιμετώπισης καλοήθων και μη ασθενειών, οι οποίες εμφανίζουν υπερανάπτυξη ανεπιθύμητων ή μη φυσιολογικών κυττάρων. Η βασική ιδέα στηρίζεται στη χορήγηση μιας μη τοξικής ουσίας, του φωτοευαισθητοποιητή (ΦΕ), ο οποίος συσσωρεύεται επιλεκτικά στα κύτταρα του όγκου, καθιστώντας τα ευάλωτα στην οπτική ακτινοβολία. Όταν ολοκληρωθεί η επωαστική περίοδος με τον ΦΕ, ακολουθεί ακτινοβόληση του όγκου με ορατό φως. Παρουσία οξυγόνου, η ενεργοποίηση του ΦΕ από την ακτινοβολία προκαλεί την παραγωγή ελευθέρων ριζών, οι οποίες είναι κυτταροτοξικές. Αποτέλεσμα της επαγόμενης κυτταροτοξικότητας είναι ο κυτταρικός θάνατος και επομένως η αποδόμηση του πάσχοντος ιστού. Η χρήση της ΦΔΘ στην αντιμετώπιση του καρκίνου θεωρείται ιδιαιτέρως ελκυστική, δεδομένης της θεμελιώδους εξειδίκευσης και επιλεκτικότητας που παρέχει. Στην παρούσα εργασία ερευνάται η συνδυαστική δράση Φωτοδυναμικής Θεραπείας και αντιοξειδωτικών σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα προστάτη. Ειδικότερα μελετήθηκε η Φωτοδυναμική δράση με δύο σκευάσματα του ΦΕ mTHPC (απλή μορφή-Foscan& λιποσωμική μορφή-Fospeg) και εκχύλισμα προερχόμενο από τον φλοιό του πεύκουPinushalepensis,πλούσιο σε πολυφαινόλες. Η αντιοξειδωτική ή/και προοξειδωτική δράση του εκχυλίσματος μελετήθηκαν συστηματικά. Καθώς παρόμοιες μελέτες οι οποίες συνδυάζουν τη ΦΔΘ με αντιοξειδωτικά σε προοξειδωτικές δόσεις έχουν δείξει συνεργειακή δράση, μελετάται εδώ το συγκριμένο εκχύλισμα. Το κείμενο είναι χωρισμένο σε δύο μέρη, στο θεωρητικό και το πειραματικό.Το θεωρητικό μέρος ξεκινά με την εισαγωγή στη Φωτοδυναμική Θεραπεία όπου παρουσιάζονται αναλυτικά οι δύο κύριες συνιστώσες της, οι φωτοευαισθητοποιητές και τα lasers. Στη συνέχεια εξηγούνται οι μηχανισμοί επίδρασης σε ατομικό, μοριακό, χημικό, υποκυττάριο και κυτταρικό επίπεδο. Ακολούθως αναφέρονται οι μηχανισμοί καταστροφής των όγκων από κυτταρικό επίπεδο μέχρι την ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος. Τα τελευταία δύο κεφάλαια του πρώτου μέρους αφιερώνονται στη συμβολή της Νανοτεχνολογίας στη ΦΔΘ και τους τρόπους ενίσχυσης της Φωτοδυναμικής δράσης. Στο πειραματικό μέρος περιγράφονται τα πρωτόκολλα που αναπτύχθηκαν, αναφέρονται τα υλικά, οι διατάξεις και οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν και παρουσιάζονται τα αποτελέσματα που εξήχθησαν. Στο τέλος γίνεται συζήτηση για τα συμπεράσματα και τις μελλοντικές προοπτικές. H μελέτη της επίδρασης του εκχυλίσματος του φλοιού του πεύκου Pinus halepensis, πραγματοποιήθηκε με πειράματα βιωσιμότητας, στα ακόλουθα στάδια: Έλεγχος Ι: τοξικότητα σκότους των δύο σκευασμάτων του ΦΕ mTHPC, Foscan και Fospeg. Έλεγχος ΙΙ: επίδραση μόνο της ακτινοβόλησης. Έλεγχος ΙΙΙ: κλασική ΦΔΘ με τα δύο προαναφερθέντα σκευάσματα. Έλεγχος ΙV: προσδιορισμός συγκέντρωσης αντιοξειδωτικού στην οποία ξεκινά η προοξειδωτική δράση. Έλεγχος V: τοξικότητα σκότους αντιοξειδωτικού και Foscan, τοξικότητα σκότους αντιοξειδωτικού και Fospeg. Έλεγχος VI: τοξικότητα αντιοξειδωτικού και ακτινοβόλησης. Έλεγχος VII: πιθανή συνεργειακή δράση ΦΔΘ και αντιοξειδωτικού.Photodynamic therapy is considered to be a promising method for the treatmentof malignant and non-malignant diseases that are generally characterized by overgrowth of unwanted or abnormal cells. The basic concept for this method consists of administering a non-toxic drug, known as a photosensitizer, which selectively accumulates by the tumor cells. After the incubation time, irradiation of the tumor follows, with visible light. In presence of oxygen, the activation of the photosensitizer through irradiation, leads to the generation of cytotoxic species and consequently to cell death and tissue devastation. The use of Photodynamic Therapy as a cancer therapy is considered particularly attractive, due to its fundamental specificity and selectivity. In the present study is investigated the combination of Photodynamic Therapy and the use of antioxidants on human prostate cancer cells. Speciffically the photodynamic action of two formulations of PS mTHPC (simple form – Foscan & liposomal form – Fospeg) and the extract from the pine Pinus halepensis bark, rich in polyphenols, is investigated. The antioxidant and/or prooxidant properties of this extract were studied in depth. Since similar studies compining PDT with antioxidants in prooxidant concentrations have demonstrated synergetic action, this particular extract is investigated. This thesis is divided in two parts, the theoretical and the experimental. The theoretical part includes firstly an introduction to Photodynamic Therapy which details its two main components, the photosensitizers and lasers. Secondly, themechanisms of the PD effect inatomic, molecular, chemical, subcellular and cellular level are explainedfollowed by the mechanisms of tumor destruction at a cellular level leading to the activation of the immune system. The last two chapters of the first part are devoted to the contribution of Nanotechnology in PDT and other ways of enhancing the photodynamic action. The experimental part details the protocols developed during the experiments, the materials, devices and methods that were used. Finally the results are presented followed by the conclusions and a discussion about future prospects. Control I: Dark toxicity of the two formulations of PS mTHPC, Foscαn and Fospeg. Control II: The effects of illumination Control III: Classic PDT using the two previously mentioned formulatios Control IV: Determination of the antioxidants concentration where its prooxidant action begins Control V: Dark toxicity of antioxidant and Foscan, dark toxicity of antioxidant ant Fospeg. Control VI: Toxicity of antioxidant under illumination Control VII: Possible synergetic action of PDT with the antioxidant.Ζαχαρένια Γ. Νικητάκ