Yersinia pseudotuberculosis on gramnegatiivinen bakteeri, jonka soluseinässä oleva ulkomembraani koostuu pääosin lipopolysakkaridista sekä fosfolipideistä ja proteiineista. Lipopolysakkaridi on tärkeä antigeeninen rakenne, joka koostuu lipidi A:sta, ydinoligosakkaridista sekä O-polysakkaridista eli O-antigeenista. O-antigeenisen osan rakenne vaihtelee hyvin paljon eri bakteereilla ja samankin bakteerilajin eri kannoilla, mihin perustuu bakteerikantojen
jako eri serotyyppeihin.
Tutkimuksen kohteena oli Yersinia pseudotuberculosis serotyypin O:9 lipopolysakkaridin O-antigeenin biosynteesiä ohjaavan geeniklusterin kloonaaminen ja sekvensointi. Kloonausvektorina käytettiin kosmidia, jolloin puhutaan kosmidikloonauksesta. Lyhyesti kuvattuna tämä tehtiin seuraavasti: Yersinia pseudotuberculosis O:9 genominen DNA digestoitiin Sau3AI-restriktioentsyymillä ja kosmidi pHC79 BamHI:llä. Tuotteet ligoitiin, pakattiin in vitro lambda-faagiin ja transduktoitiin E. coli LE 392 -soluihin.
Kosmidikirjaston valmistuttua se seulottiin. Geeniklusterin geeneistä wzz-geenin sekvenssi on tiedossa, mikä on mahdollistanut spesifisen PCR- eli polymeraasiketjureaktiomenetelmän kehittämisen geeniklusterin identifioimiseksi. wzz-positiivisten kloonien sisältämät
kosmidit eristettiin ja kosmidien inserttien ääripäät sekvensoitiin.
Sekvensoinnista saatuja tuloksia verrattiin geenipankin Yersinia pseudotuberculosis -kantojen DNA-sekvensseihin ja varsin ajoissa heräsi epäilys siitä, että insertit sisältävät
monta lyhyttä Sau3AI-digestiotuotetta, jotka ovat ligoituneet toisiinsa.
Kosmidikirjasto tehtiin uudelleen. Suuri määrä genomista DNA:ta digestoitiin partiaalisesti ja tällä kertaa lyhyet Sau3AI-digestiotuotteet poistettiin sokerigradienttiajolla. Saadut pitkät genomiset DNA-fragmentit ligoitiin kosmidiin, pakattiin ja transduktoitiin E. coliin. Tämän seurauksena saatiin yli 20000 kloonin kosmidikirjasto. Positiivisten kloonien seulonta tulee olemaan seuraava tehtävä tässä projektissa.The aim of this research was to clone the O-antigen gene cluster of Yersinia pseudotuberculosis serotype O:9 and to perform a sequence analysis. The cloning vector was a
cosmid, hence the cloning is called cosmid cloning. Briefly, Yersinia pseudotuberculosis O:9 genomic DNA was digested with restriction enzyme Sau3AI and cosmid pHC79 was digested with BamHI. Digestion products were directly ligated, packaged in vitro into a lambda-phage using a packaging extract and transduced into E. coli LE 392 cells.
The created cosmid library was then screened for positive clones that carry the O-antigen gene cluster. The sequence of the wzz-gene of the gene cluster is known which made it
possible to design a specific PCR (polymerase chain reaction) method for the identification of the presence of the gene cluster. wzz-positive cosmids were isolated and the extreme ends of the inserts in the cosmids were sequenced.
The obtained sequences were compared to known genome sequences of Yersinia pseudotuberculosis strains in data banks. The results indicated that the constructed genomic
library was of poor quality since inserts contained many short Sau3AI fragments ligated to each other.
Therefore a new cosmid library was created. A large amount of genomic DNA was digested partially by Sau3AI and this time the short Sau3AI fragments were removed from the digest using sucrose gradient fractionation. The obtained long genomic DNA fragments were ligated to the cosmid vector, packaged and transduced into E. coli. This resulted in cosmid library with >20000 clones. The screening for positive clones will be the
next task in the project
