Study on the processing of the surface glycoprotein of 82 kDa(GP82) from metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi

Abstract

Os tripomastigotas metaciclicos de Trypanosoma cruzi sintetizam uma glicoproteina de superficie estagio-especifica de 82 kDa (GP82) que esta envolvida na entrada do parasita nas celulas hospedeiras. A GP82 encontra-se ligada a superficie celular por uma ancora de glicosilfosfatidilinositol (GPI). As proteinas ligadas por GPI sao sintetizadas com uma extremidade C-terminal que e substituida por uma ancora GPI numa reacao de transamidacao que acontece pos-traducionalmente. A sequencia da GP82 que determina a adicao da ancora GPI contem 25 aminoacidos distribuidos no sitio w, seguindo-se uma sequencia espacadora (7 aminoacidos) e uma regiao mais hidrofobica (15 aminoacidos). O sitio w, reponsavel pela clivagem e adicao da ancora GPI, e composto por 3 aminoacidos: o aminoacido w ao qual a ancora GPI e tranferida, e Asp; o aminoacido w+1 e Gly e o aminoacido w+2 e Ser. Visando determinar experimentalmente a sequencia para ancoragem por GPI em T. cruzi, fizemos uma mutacao no putativo sitio de clivagem e adicao (sitio w) da ancora. Por meio de mutacao sitio-dirigida foi gerada uma substituicao do aminoacido no sitio w (posicao 492), onde o codon GAC foi trocado por TCC, assim o motivo de clivagem e adicao Asp-Gly-Ser presente na proteina nativa foi substituido por Ser-Gly-Ser. Para avaliar o processamento de uma proteina com sinal defectiva para adicao de GPI, geramos uma GP82 truncada, eliminando todo o sinal C-terminal incluindo-se o sitio c). As duas construcoes foram clonadas no vetor pTEX e inseridas em epimastigotas (cepa G) por meio de eletroporacao. A incorporacao do plasmidio foi confirmada por analise de Southern blot apos diGestão com Xho I, e a transcricao dos genes transfectados por analise de northem blot. A traducao dos genes exogenos foi analisada por western blot empregando um anticorpo monoclonal especifico para GP82 (MAb-3F6), e a localizacao celular dos produtos traduzidos foi feita por imunofluorescencia e...(au)BV UNIFESP: Teses e dissertaçõe