Uso de celulas da medula ossea congeladas para estudo de cariotipo

Abstract

O estudo citogenetico habitual utiliza-se de celulas frescas para a cultura, o que limita o numero de experimentos a serem realizados. Este fato tem despertado o interesse de alguns pesquisadores em avaliar o uso de celulas congeladas para analise de cariotipo. Muito pouco tem sido modificado nas tecnicas de congelamento e descongelamento desde sua descricao, apenas o aprimoramento das mesmas tornando-as menos complexas e mais utilizaveis. O presente trabalho analisa os efeitos de metodo simplificado de criopreservacao no estudo citogenetico de celulas de medula ossea, utilizando agentes crioprotetores de baixo e alto peso molecular, sem velocidade de congelamento controlada. Avalia, tambem, o uso de GM-CSF como fator estimulante de crescimento e sua interferencia na qualidade das metafases. Para avaliar o efeito proliferativo do GM-CSF, utilizou-se o indice mitotico nas culturas de celulas a fresco e congeladas. O teste de viabilidade celular, azul de Trypan, foi realizado em todas as amostras para determinar o efeito do congelamento sobre as celulas. A concentracao media de celulas congeladas foi de 25,0 x 106 celulas / mL. As celulas foram criopreservadas em Normosol R contendo ohydroxyethylstarcho (HES) 12%, albumina humana 8% e imetilsulfoxido (DMSO) 10%. As celulas de medula ossea foram adicionados volumes iguais de solucao crioprotetora e a concentracao final foi HES 6%, Albumina Humana 4% e DMSO 5%. Foram estudadas 25 amostras de 24 individuos, sendo 8 com LMC, 6 com LMA, 3 com SMD, 2 com LLA-T, 1 com linfoma linfoblastico leucemizado, 1 doador de medula ossea para transplante, 1 com anemia megaloblastica, 1 com LMA em remissao ha 2 anos e 1 com LLA em remissao ha 4 anos. As celulas de medula ossea foram separadas em dois grupos: um para cultura a fresco e o outro para congelamento. Foram feitas duas culturas: uma simples e outra com GM-CSF antes e apos o congelamento. Por volta de 3 meses, as celulas congeladas foram descongeladas rapidamente por imersao em banho Maria a 37 C sem agitacao e diluidas com tres volumes de meio RPMI 1640. O material foi ressuspenso e dividido em duas culturas, uma com GM-CSF e outra sem. O teste de viabilidade celular pre e pos congelamento mostrou valores medios de 98,8% e 78,5% respectivamente. O teste t pareado, foi estatisticamente significante (p = 0,000), confirmando que a criopreservacao induziu um decrescimo na viabilidade celular e consequentemente no indice mitotico. Obteve-se sucesso em 76% dos casos de cultura de celulas a fresco e em 52% das congeladas, embora os aspectos morfologicos foram semelhantes em ambas. Em relacao ao indice mitotico, nao houve diferenca estatisticamente significante pelo teste t entre as culturas com e sem GM-CSF (p = 0,084). O uso de GM-CSF nao melhorou a quantidade e qualidade das metafases. Os dados mostram que os estudos em celulas congeladas nao devem substituir os de celulas a fresco, salvo nos casos de auto transplante e em pesquisasBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe