Muscarinic acetylcholine receptors in sertori cells

Abstract

O objetivo do presente trabalho foi caracterizar os receptores muscarinicos nas celulas de Sertoli de rato. Cultura primaria de celulas de Sertoli foram obtidas de ratos com 30 dia de idade. O ensaio da transcriptase reversa seguido da reacao em cadeia da polimerase (RT-PCR) foi realizado com DNA complementar obtido a partir do RNA mensageiro das celulas de Sertoii e primers especificos para os cinco subtipos de receptor muscarinico. Foram amplificados a produtos de tamanhos especificos correspondendo aos cinco subtipos: m1 = 641 -, m2 = 552; m3 = 790; m4 = 51O e m5 = 451 pares de bases. Pelo ensaio de protecao a ribonuclease (RPA), utilizando ribosondas produzidas a partir de sequencia distinta entre os cinco subtipos de receptores muscarinicos, localizada na terceira alca intracitoplasmatica do receptor, foram detectados quatro transcritos para os receptores muscarinicos, correspondentes aos subtipos m1 = 377; m2 = 547; m3 = 687 e m4 = 519 nucleotideos. Nas condicoes utilizadas neste ultimo ensaio, o transcrito m5 nao foi detectado. Os estudos de saturacao foram realizados em celulas de Sertoli incubadas com o [3H]Quinuclidinyl benzilate ([3H]QNB) (O,1 nM a 4 nM), por 2 horas a 4§ C, na ausencia (ligacao total) e na presenca (ligacao inespecifica) de atropina (l nM). A ligacao do [3H]QNB as celulas de Sertoli foi especifica, saturavel, dependente de tempo e temperatura de incubacao. A analise de Scatchard revelou a presenca de um unico sitio de ligacao para o @HIQNB, com uma constante de dissociacao (KD = 1,78 n O,32 nM) e densidade de receptores (Bmax) = 221,0 n 20,0 fmol/mg de proteina. O antagonista muscarinico, atropina (nao seletivo), deslocou a ligacao especifica do [3H]QNB e a melhor curva que se ajustou aos dados foi uma sigmoide complexa, com um coeficiente de Hill de O,47 n O,09, sugerindo a presenca de mais de um sitio de ligacao e/ou estado de afinidade diferente de um mesmo sitio de ligacao. Os valores de PKi para a atropina foram 7,9 n O,80 e 3,3 n O,23. O acumulo intracelular de AMP ciclico induzido pelo forskolin (lO-5 M) foi determinado na ausencia e presenca do carbacol (lO-3 M) e diferentes antagonistas muscarinicos. O forskolin, que estimula diretamente a enzima adenililciclase, produziu um aumento, dependente da concentracao, no conteudo intracelular de AMP ciclico. O aumento de AMP ciclico, induzido pelo forskolin (1O-5 M), foi reduzido pelo carbacol 10-5M, 10-4M e 10-3 M de 23 por cento,...(au)BV UNIFESP: Teses e dissertaçõe