An outbreak of diarrhea in adult cattle from a dairy herd of Lavras county, MG, was described. From a herd of 10 cows, seven became ill. The diarrhea lasted six to 10 days, being more prolonged, intense, and with blood in lacting cows. Other signs included apathy, reduced appetite and milk production, and serous nasolacrimal discharge. Bovine coronavirus was detected in fecal samples from the five cattle tested by nested-RT-PC

BEZERRA JUNIOR, P. S.

BRANDÃO, Paulo Eduardo

COSTA, G. M.

JEREZ, José Antonio

PAVARINI, S. P.

VARASCHIN, M. S.

VILLARREAL BUITRAGO, Laura Yaneth

WOUTERS, F.

Biblioteca Digital da Produção Intelectual da Universidade de São Paulo (BDPI/USP)

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.61, n.4, p.992-995, 2009 
Comunicação 
 
[Communication] 
 
Surto de diarreia em vacas de um rebanho leiteiro na região sul de Minas Gerais: detecção 
de coronavírus bovino nas fezes 
 
[Outbreak of diarrhea in cows from a dairy herd in the southern region of Minas Gerais State:  
detection of bovine coronavirus in the feces] 
 
P.S. Bezerra Jr1, P.E. Brandão2, S.P. Pavarini3, M.S. Varaschin1, F.Wouters1, 
 L.Y.B. Villarreal4, J.A. Jerez2, G.M. Costa1 
 
1Departamento de Medicina Veterinária - UFLA – Lavras, MG 
2Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - USP – São Paulo, SP 
3Aluno de pós-graduação - UFRGS – Porto Alegre, RS 
4Intervet-Schering Plough – São Paulo, SP 
  
                                                          
Recebido em 4 de novembro de 2008 
Aceito em 23 de junho de 2009 
E-mail: bezerraj@ufla.br 
Uma síndrome clínica afetando bovinos adultos, 
caracterizada por diarreia ou disenteria profusa, 
aguda, associada à drástica diminuição da 
produção de leite e graus variáveis de depressão, 
anorexia e sinais respiratórios, tem sido descrita 
em diversos países (Saif, 1990). A doença tem 
sido denominada disenteria de inverno, embora 
alguns surtos possam ocorrer também em 
estações quentes (Park et al., 2006). Em geral, 
sua morbidade é alta, mas a letalidade é baixa ou 
nula (Saif, 1990). 
 
Desde a década de 70, vários trabalhos vêm 
apontando o envolvimento do coronavírus 
bovino nestes surtos (Van Kruiningen et al. 
1987; Saif et al. 1991; Travén et al., 2001). No 
Brasil, a primeira detecção de coronavírus nas 
fezes de vacas adultas com diarreia foi relatada 
por Brandão et al. (2002) no Estado de São 
Paulo. Desde então, vários trabalhos têm 
ressaltado a importância do vírus em surtos de 
diarreia em bovinos adultos (Brandão et al., 
2007a, b). Dados sobre a relevância do 
coronavírus em surtos de diarreia em bovinos 
adultos em outras regiões do país se fazem 
necessários. No presente trabalho foi realizada a 
pesquisa do coronavírus bovino pela técnica de 
nested-RT-PCR em amostras fecais de bovinos 
adultos em um surto de diarreia em Lavras, 
Minas Gerais, sendo pesquisados também  
outros agentes infecciosos. Os aspectos 
epidemiológicos e clínicos deste surto foram 
apresentados. 
 
Os dados clínicos e epidemiológicos do surto 
foram obtidos junto ao proprietário em visitas à 
propriedade onde ocorreu a enfermidade. Na 
primeira visita, durante a ocorrência do surto, 
foram coletadas fezes do reto de cinco vacas com 
sinais clínicos, que foram mantidas sob 
refrigeração até o envio aos laboratórios para 
exames bacteriológico, parasitológico e 
virológico. Além disso, amostras de sangue de 
três vacas com diarreia foram coletadas durante a 
primeira visita e 15 dias após para realização de 
sorologia pareada para diarreia viral bovina 
(BVD). 
 
A bacteriologia constou principalmente da 
pesquisa de Salmonella sp, tendo sido empregada 
a metodologia de análise preconizada por 
Koneman et al. (2001). A avaliação 
parasitológica consistiu da determinação do 
número de ovos (OPG) e oocistos (OOPG) por 
grama de fezes, segundo a técnica descrita por 
Sloss et al. (1999). Amostras pareadas de soro 
foram encaminhadas ao laboratório de virologia 
para diagnóstico sorológico de BVD pela prova 
de soro-neutralização (Ridpath e Flores 2007). 
 
O coronavírus bovino (BCoV) foi pesquisado nas 
amostras fecais por meio da reação em cadeia da 
polimerase (PCR) dirigida ao gene codificador 
Surto de diarreia em vacas... 
Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.61, n.4, p.992-995, 2009 993
da RNA-polimerase RNA-dependente (Rd Rp) 
dos coronavírus, utilizando-se primers e 
condições de reação descritos por Stephensen et 
al. (1999) e Brandão (2004), com algumas 
modificações (Tab. 1).  
 
As amostras fecais foram preparadas como 
suspensões a 50% em PBS 0,01M/BSA 0,1% pH 
7,2 (PBS) e clarificadas a 12.000 x g durante 30 
minutos a 4ºC, tomando-se o sobrenadante como 
amostra. A transcrição reversa (sintese de c-
DNA) foi realizada a 42ºC/60’ em um mix 
contendo 1 x first strand buffer1, 1mM de cada 
dNTP, 10mM DTT, 1µM de cada primer 2Bp e 
4Bm (Stephensen et al., 1999), 7µL de RNA 
extraído pelo método do trizol (Invitrogen) (de 
acordo com as instruções do fabricante e 
desnaturados a 95Cº/5’) e 200U de M-MLV 
Reverse Transcriptase1 para uma reação final de 
20µL. A seguir, 5µL de c-DNA assim obtido 
foram adicionados ao PCR mix (1 x PCR buffer1, 
0,2mM de cada dNTP, 0,5µM de cada primer 
(2Bp e 4Bm), 1,5mM MgCl2, 25,25µL de água 
ultrapura e 1,25U Taq DNA polimerase para uma 
reação final de 50µL e submetidos a seis ciclos 
de 94ºC/1’, 40ºC/2’ e 72ºC/1’, 36 ciclos de 
94ºC/1’, 50ºC/1,5’ e 72ºC/1’, seguidos por 
72ºC/10’ para extensão final. A fase de nested-
PCR foi realizada com 5µL do produto da 
primeira PCR assim obtido adicionados ao mix 
contendo 1 x PCR buffer1, 0,2mM de cada 
dNTP, 0,5µM de cada primer CV2L e CV2U 
(Brandão, 2004), 1,5mM MgCl2, 25,25µL de 
água ultrapura e 1,25U Taq DNA polimerase) e 
submetidos a 26 ciclos de 94ºC/1’, 54,8ºC/1,5’ e 
72ºC/1’ seguidos por 72ºC/10’ para extensão 
final.  
A amostra padrão Kakegawa de BCoV (Akashi 
et al., 1980) foi incluída como controle positivo, 
e o PBS como controle negativo; ainda, na 
reação nested, foi incluído um tubo com água 
ultrapura a cada três amostras, processado em 
conjunto com estas, com o intuito de se 
monitorarem contaminações por DNA 
amplificado. A seguir, 10µL do produto de 
nested PCR foram resolvidos em eletroforese em 
gel de agarose a 1,5%, corado com brometo de 
etídeo e observado em luz ultravioleta, 
considerando-se positivas as amostras que 
apresentaram banda de 136 pares de bases. Cada 
uma das fases (preparação das amostras e 
extração de RNA, transcrição reversa e PCR, 
nested-PCR e eletroforese) foi realizada em 
ambientes separados, visando evitar 
contaminações. 
 
Rotavírus foram pesquisados por meio da técnica 
de eletroforese em gel de poliacrilamida (Herring 
et al., 1982). Suspensões fecais a 20% foram 
preparadas em tampão TRIS 0,01M/ CaCl2 
0,0015M pH 7,3, centrifugando-se a 12000 x 
g/30’, extraindo-se o RNA do sobrenadante com 
fenol-clorofórmio, procedendo-se à eletroforese 
em gel de poliacrilamida descontínuo a 
3,5%/7,5% e corando-se com nitrato de prata. 
Foram consideradas positivas as amostras que 
apresentaram padrão de migração das bandas de 
RNA similares aos apresentados pela amostra 
NCDV (Nebraska Calf Diarrhea Virus) de 
rotavírus (White et al., 1970) incluída como 
controle positivo. Ainda, como controle 
negativo, foi utilizado PBS. 
  
Tabela 1. Primers utilizados para a detecção do gene codificador da RNA-polimerase RNA-dependente 
(Rd Rp) dos coronavírus 
Primer Sequência Fragmento amplificado 
4Bm  5’ TCACAYTTWGGATARTCCCA 3’ 
2Bp  5’ ACTCARWTRAATYTNAAATAYGC 3’ 
251pb 
CV2U  5’ TACTATGACTGGCAGAATGTTTCA 3´ 
CV2L  5´AACATCTTTAATAAGGCGRCGTAA 3´ 
136pb 
 
                                                          
1Invitrogen, Life Technologies - Carlsbat, EUA. 
O surto de diarreia ocorreu durante os meses de 
agosto e setembro de 2003, na comunidade Santa 
Cruz, distrito Três Barras, Município de Lavras, 
MG. De um rebanho leiteiro de 10 vacas, sete 
adoeceram, duas delas em lactação. Inicialmente, 
as vacas apresentaram apatia, pelos arrepiados, 
Bezerra Jr. et al. 
Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.61, n.4, p.992-995, 2009 994 
corrimento seroso nasolacrimal, redução do 
apetite e queda súbita na produção leiteira. As 
vacas em lactação apresentaram fezes pastosas a 
líquidas, esverdeadas com estrias de sangue, 
enquanto as demais tiveram diarreia mais branda, 
sem sangue. O quadro clínico nas vacas em 
lactação se estendeu por oito a 10 dias, enquanto 
nas vacas secas foi de seis a sete dias. Os animais 
se recuperaram sem tratamento. Antes da doença 
clínica, a produção média diária por vaca era de 
20 litros, caindo para menos de dois litros. A 
produção só voltou a aumentar em torno de cinco 
dias após o fim da diarreia, contudo não 
atingindo os níveis anteriores (no máximo 10 
litros/dia). O proprietário não observou doença 
clínica nos bezerros no período do surto, tendo 
relatado que durante os doze anos anteriores ao 
surto, não havia observado quadro clínico 
semelhante na propriedade. Segundo o 
proprietário, o rebanho não apresentou 
problemas de repetição de cio, abortos ou 
nascimento de bezerros fracos durante ou após o 
período do surto. 
 
Todas as cinco amostras analisadas resultaram no 
fragmento esperado de 136pb após a PCR, 
evidenciando nelas a presença do BcoV. 
Nenhuma banda foi evidenciada nas reações 
referentes aos controles negativos e controles 
inseridos na fase de nested. As cinco amostras 
foram negativas para rotavírus em PAGE, e as 
análises bacteriológicas das fezes também foram 
negativas. As três vacas testadas não 
apresentaram soroconversão para BVD. A 
contagem de OPG de fezes variou de índices não 
detectáveis a 300 OPG, enquanto a contagem de 
OOPG foi negativa em todos os bovinos 
testados.  
 
Os aspectos clínicos e epidemiológicos do surto 
são compatíveis com os descritos na disenteria 
de inverno (Saif, 1990). Os resultados dos 
exames laboratoriais, a exemplo do que tem sido 
descrito por diversos autores (Van Kruiningen et 
al., 1987; Saif et al., 1991; Travén et al., 2001; 
Brandão et al., 2002; 2007a, b), reforçam o 
envolvimento do coronavírus bovino no surto 
descrito. A técnica de reação em cadeia pela 
polimerase mostrou-se útil para o diagnóstico 
rápido da presença do coronavírus em amostras 
fecais de vacas com diarreia. Não foram 
detectadas coinfecções por rotavírus, vírus da 
diarreia viral bovina e salmonela. As contagens 
de ovos detectadas nas fezes de alguns animais 
não têm sido consideradas de significância 
clínica (Sloss et al., 1999).  
 
Deve-se considerar, no diagnóstico diferencial, 
outras doenças não relacionadas ao coronavírus 
bovino que podem causar diarreia de curso 
abrupto e curto em bovinos adultos, como 
diarréia viral bovina, coccidiose, deficiência de 
cobre associada ao excesso de molibdênio e 
diarreia dietética (Radostits et al., 2000), assim 
como a possibilidade de ocorrerem coinfecções. 
 
Os históricos de surtos similares sugerem que a 
doença pode ter um impacto importante na 
pecuária da região sul de Minas Gerais. Vários 
aspectos da cadeia epidemiológica e patogênese 
desta doença, tais como as fontes de infecção e 
vias de transmissão envolvidas, precisam de 
esclarecimento, o que demonstra a necessidade 
de pesquisas nestas áreas. 
 
Palavras-chave: gado de leite, diarreia, disenteria 
de inverno, coronavírus  
  ABSTRACT 
 
An outbreak of diarrhea in adult cattle from a dairy herd of Lavras county, MG, was described. From a herd of 
10 cows, seven became ill. The diarrhea lasted six to 10 days, being more prolonged, intense, and with blood in 
lacting cows. Other signs included apathy, reduced appetite and milk production, and serous nasolacrimal 
discharge. Bovine coronavirus was detected in fecal samples from the five cattle tested by nested-RT-PCR. 
 
Keywords: dairy cow, diarrhea, winter dysentery, coronavirus 
 
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São Paulo e Minas Gerais, Brasil. 2004. 79f. Tese 
Surto de diarreia em vacas... 
Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.61, n.4, p.992-995, 2009 995
(Doutorado). - Faculdade de Medicina Veterinária e 
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Outbreak of diarrhea in cows from a dairy herd in the southern region of Minas Gerais State: detection of bovine coronavirus in the feces

http://www.scielo.br/pdf/abmvz/v61n4/v61n4a30.pdf

Outbreak of diarrhea in cows from a dairy herd in the southern region of Minas Gerais State: detection of bovine coronavirus in the feces

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