Die biokatalytische Produktion von Fein- und Bulk-Chemikalien ist von wachsender Bedeutung für die Entwicklung nachhaltiger Synthesewege. P450 Monooxygenasen spielen eine Schlüsselrolle in der selektiven Funktionalisierung von nicht-aktivierten C-Atomen mit Luftsauerstoff, eine der Hauptherausforderungen in der organischen Synthese. Insbesondere die industrielle Synthese von Phenol, unter Verwendung von Benzol als Startmaterial, ist ineffizient und nur durch den hohen Bedarf des Nebenproduktes Aceton profitabel. Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Entwicklung von Varianten der bakteriellen P450 Monooxygenase BM3 aus Bacillus megaterium zur Anwendung in der Synthese von Phenolen. Das Hauptziel dieser Arbeit ist die Entwicklung einer effizienten P450 Monooxygenase für die Produktion industriell bedeutender o-Phenole, die als Bausteine für die Synthese von Pharmazeutika, Plastik oder Vitaminen verwendet werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurden P450 BM3 Varianten identifiziert, welche eine verbesserte Aktivität für Benzolsubstrate aufweisen, sowie eine effizientere Nutzung des NADPH Co-Faktors und ein breiteres Substratspektrum. Dreißig potentielle Substrate wurden mit der Variante M2 (R47S, Y51W, I401M) untersucht und die Umsetzung von 12 Benzolen im Detail charakterisiert. Insbesondere die Hydroxylierung von Anisol mit Variante M3 (R47S, Y51W, A330F, I401M) war besonders effizient (>95% Selektivität o-Position), wobei eine finale Produktkonzentration von mehr als einem 1 g/L erreicht wurde. Neben dem breiterem Substratspektrum und der Entwicklung eines Protokolls für die semi-präparative Synthese der entsprechenden Phenole, wurde der Einfluss von weitläufig verwendeten Lösungsvermittlern wie DMSO auf die aromatische Hydroxylierung von Toluol untersucht. Die effizienteste Produktion von o-Kresol war möglich ohne den Einsatz von zusätzlichen Lösungsvermittlern, was eine kostengünstigere Synthese und vereinfachte Produktaufreinigung erlaubt. Die katalytische Charakterisierung der entsprechenden P450 BM3 Varianten wurde durch Substrat-Docking Studien zur Aufklärung der Selektivitäten ergänzt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die aromatische Hydroxylierung von Benzolen durch Wechselwirkungen mit Phenylalanine 87 im aktiven Zentrum von P450 BM3 dirigiert wird. Der Austausch von F87 gegen alle 19 kanonischen Aminosäuren führt zu einem Verlust der Fähigkeit von P450 BM3 zur effizienten aromatischen Hydroxylierung von p-Xylol. Daraus lässt sich erschließen, dass die Aminosäure F87 essentiell für die aromatische Hydroxylierung von Benzolen durch P450 BM3 ist. Die systematische Untersuchung ausgewählter Substrate unterstützt die Hypothese, dass sowohl Regioselektivität als auch Aktivität insbesondere durch pi-pi-Wechselwirkungen zwischen Protein und Benzol-Substraten gesteuert wird. Der Austausch von Alanin gegen Phenylalanin an Position 330, nahe am aktiven Zentrum von P450 BM3, erlaubt eine stärkere Bindung und bis zu 49-fach erhöhte Aktivität für Mesitylen. Katalytische Daten und Docking Ergebnisse weisen in beiden Untersuchungen auf eine T-förmige Bindung der Benzole im aktiven Zentrum von P450 BM3 hin. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die Entwicklung von zwei neuartigen Methoden für die Gelenkte Evolution von Biokatalysatoren beschrieben, OmniChange und PTRec. OmniChange ermöglicht zum ersten Mal die effiziente und zuverlässige Saturierung von bis zu fünf unabhängigen Aminosäuren innerhalb einer DNA Sequenz, wobei die aktuellen Anforderungen in der fokussierten Mutagenese erfüllt werden. Die detaillierte Analyse von 48 sequenzierten Klonen hat gezeigt, dass bis zu 84% aller möglichen Codons an den ausgewählten Positionen eingebaut wurden. Ein einfaches und robustes Protokoll erlaubt insbesondere die Untersuchung kooperativer Effekte in Proteinstrukturen. Basierend auf dem OmniChange Protokoll wurde die PTRec Methode zur Rekombination von Proteinen mit weniger als 50% Sequenzidentität entwickelt. Beispielhaft wurde eine Modellbibliothek bestehend aus drei Phytase-Sequenzen generiert. Die Chimären wurden sequenziert und die Verteilung der spezifischen Domänen untersucht. Hierbei konnte eine nahezu statistisch ideale Verteilung der spezifischen Domänen festgestellt werden. OmniChange und PTRec basieren auf der Verwendung phosphoro-thiolierter Nukleotide, welche eine robuste und nahezu sequenzunabhängige Assemblierung von bis zu fünf DNA Fragmenten ermöglichen. In beiden Fällen war E. coli in der Lage die assemblierten, nicht-ligierten Plasmide aufzunehmen und als funktionelle Plasmide zu replizieren, wobei die 10 DNA-nicks kein Problem darstellten. Anhand der beiden entwickelten Methoden können einzigartige Biokatalysatoren für spezifische Anwendungen wie z.B. für biokatalytische Prozesse maßgeschneidert werden
