Metabolismus des tabakspezifischen Nitrosamins N\u27-Nitrosonornicotin in Gewebeschnitten von Mäusen, Ratten und Menschen sowie Möglichkeiten der Hemmung durch Nicotin, Cotinin und Phenethylisothiocyanat

Abstract

Das Ziel dieser Arbeit war es, speziesspezifische Unterschiede in der Metabolisierung des tabakspezifischen Nitrosamins N\u27-Nitrosonornicotin (NNN) in den Organen Lunge und Leber von Mäusen, Ratten und Mensch zu untersuchen. Gewebeschnitte von Lunge und Leber der Maus, Ratte und des Menschen wurden unter identischen Versuchsbedingungen mit [5-3H]-NNN sechs Stunden inkubiert. Es kamen je 8 Konzentrationen von 0,001 bis 1,2 µM zum Einsatz. Bei Maus und Ratte wurden pro Konzentration die Schnitte von je 6 Tieren untersucht. Art und Menge der entstandenen Metaboliten, wurde durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit on-line Radioaktivitätsdetektion ermittelt. Die Zuordnung der Metaboliten erfolgte durch Co-Chromatographie von Referenzsubstanzen, die durch UV-Detektion bei 245 nm bestimmt wurde. Zur Vitalitätsbestimmung der Gewebeschnitte wurde der LDH-Austritt aus der Zelle über den gesamten Versuchszeitraum bestimmt. Von den vier Hauptreaktionswegen des NNN-Metabolismus, die alpha- und beta-Hydroxylierung an den Positionen 2\u27 und 5\u27 bzw. 3\u27 und 4\u27 des Pyrrolidinrings, die Pyridin-N-Oxidation und die Bildung von Nornicotin, wird nach bisherigen Erkenntnissen nur die 2\u27-Hydroxylierung als Aktivierungsweg betrachtet, der nach Bildung einer instabilen Zwischenstufe, die mit zellulären Makromolekülen wie der DNA reagieren kann, die Basis für die kanzerogene Wirkung von NNN schafft. In den Gewebeschnitten wurden nur Metabolite der alpha-Hydroxylierung und das Norcotinin nachgewiesen. Die Inkubationsversuche mit den Lungen der Versuchstiere Maus und Ratte ergaben, dass die Verstoffwechslung von NNN bei beiden Spezies hauptsächlich über die alpha-Hydroxylierung an der 2\u27-Position stattfindet. Im Gegensatz zu den Nagern ließ die Inkubation von humanen Lungenschnitten nach sechs Stunden keine messbaren Umsätze erkennen. Erst der Einsatz erhöhter Mengen von radioaktivem NNN lieferte erste Anzeichen, dass auch in der Humanlunge die Verstoffwechslung über die 2\u27-Hydroxylierung abläuft. In der Leber ergaben sich bei allen untersuchten Spezies recht unterschiedliche Ergebnisse. Während in der Mäuseleber über den gesamten Konzentrationsbereich der größte Anteil über die alpha-Hydroxylierung vorwiegend an der 2\u27-Position metabolisiert wurde, fand in Ratten hauptsächlich eine Entgiftung über Norcotinin statt. Anders als bei den Nagern wurde in den humanen Leberschnitten, die im Vergleich zur Humanlunge eine wesentlich höhere Metabolisierungskapazität aufwiesen, das Nitrosamin NNN hauptsächlich über die alpha-Hydroxylierung an der 5\u27-Position metabolisiert, die nach bisherigen Erkenntnissen keine Aktivierung darstellt. Insgesamt erwies sich die Maus, sowohl in der Leber als auch in der Lunge als die Spezies mit der höchsten Kapazität NNN zu metabolisieren. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Möglichkeiten untersucht, den Metabolismus von NNN durch verschiedene Substanzen, die sich in der Vergangenheit schon erfolgreich als Hemmstoffe bzw. Chemopräventoren bezüglich tabakspezifischer Nitrosamine darstellten, zu beeinflussen. Hierzu wurden die Gewebeschnitte zusätzlich zu den verschiedenen NNN-Konzentrationen mit jeweils definierten Konzentrationen des Alkaloids Nicotin, seinem Hauptmetaboliten Cotinin und dem Pflanzeninhaltsstoff Phenethylisothiocyanat (PEITC) inkubiert. Bei humanen Lungenschnitten konnten diese Hemmversuche wegen des geringen NNN-Umsatzes nicht durchgeführt werden. Die Co-Inkubation von Nicotin und Cotinin bewirkte in beiden untersuchten Organen, sowohl bei der Maus als auch bei der Ratte, einen deutlichen Rückgang der Metabolitenbildung. Ebenso konnten bezüglich des NNN-Metabolismus der humanen Leber erste Hinweise auf eine Hemmung des Stoffwechsels durch diese Substanzen gewonnen werden. Dabei ergab sich nur bei Schnitten von Rattenlungen eine Verschiebung der Metabolitenverhältnisse zugunsten der 5\u27-Hydroxylierung, während in der Lunge von Mäusen und in der Leber aller Spezies die Hemmung durch Nicotin und Cotinin alle Metabolitenwege gleichermaßen betraf. Das vieldiskutierte Chemopräventivum PEITC zeigte in Leberschnitten von Mäusen und Ratten nicht über den gesamten Konzentrationsbereich einen Hemmeffekt, während beim Menschen ein deutlicher Rückgang der hepatischen NNN-Metabolisierung zu beobachten war. In Lungenschnitten hemmte PEITC die Metabolisierung von NNN deutlicher bei der Ratte als bei der Maus