Compounds with anticoagulant activity have been extracted from plant (Vaccinium myrtillus). The action of effectors realize at intrinsic way of blood coagulation. In this work we study influences of new plantderived direct anticoagulant in vitro and in vivo (in laser-induced model of thrombosis) at hemostasis and hemodynamics and compare its effects with heparin

Greimel, Ellen

Herpertz-Dahlmann, Beate

Konrad, Kerstin

Буслаева, Н. Н.

Бояринцев, Д. И.

Electronic archive of Tomsk Polytechnic University

XIV МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СТУДЕНТОВ, АСПИРАНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ «ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ НАУК» 31  Россия, Томск, 25-28 апреля 2017 г. Том 4. Биология и фундаментальная медицина    ПОЛУЧЕНИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ НОВОГО АНТИКОАГУЛЯНТА ПРЯМОГО ДЕЙСТВИЯ Н.Н. Буслаева, Д.И. Бояринцев Научный руководитель: к.б.н. Е.П. Калинин Тюменский государственный медицинский университет Россия, г. Тюмень, ул. Одесская, 54, 625023 E-mail: natalie.buslaeva@gmail.com  PREPARATION AND EXPERIMENTAL EFFICIENCY MARK OF  NEW DIRECT ANTICOAGULANT N.N. Buslaeva, D.I. Boyarintsev Scientific Supervisor: Ph.D. E.P. Kalinin Tyumen State Medical University, Russia, Tyumen, Odesskaya str., 54, 625023 E-mail: natalie.buslaeva@gmail.com  Abstract. Compounds with anticoagulant activity have been extracted from plant (Vaccinium myrtillus). The action of effectors realize at intrinsic way of blood coagulation. In this work we study influences of new plant-derived direct anticoagulant in vitro and in vivo (in laser-induced model of thrombosis) at hemostasis and hemodynamics and compare its effects with heparin.  Введение. В лабораториях Тюменского ГМУ из растений, произрастающих в Западной Сибири, получены экстракты, обладающие антикоагулянтной активностью [1]. Существующие данные говорят о высокой противосвертывающей активности растительных эффекторов, приемлемой продолжительности действия и низкой токсичности [2, 3]. Однако их влияние на гемостаз оценено, главным образом, с использованием «пробирочных» тестов, а для тестирования использовались суммарные экстракты, без выделения действующего вещества, что делает моделирование претромботических и тромботических состояний для оценки их противосвертывающей активности актуальным.  Материалы и методы исследования. Антикоагулянт получали из листьев черники обыкновенной (Vaccínium myrtíllus) по разработанной в нашей лаборатории оригинальной методике. Оценку показателей свертывания крови (активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), тромбиновое время (ТВ) и протромбиновое время (ПВ)) проводили на автоматическом коагулометре «Solar» (Беларусь) с использованием стандартных тест-систем. Агрегацию тромбоцитов исследовали с помощью анализатора «Biola-LA 230» (Россия) и наборов «Технология-Стандарт» (Россия). Исследование деформируемости эритроцитов проводили методом эктацитометрии в проточной камере. Для тестирования антикоагулянта in vivo использовали самцов белых беспородных крыс. Работу с животными проводили с соблюдением принципов гуманности (директива 86/609/ЕЕС и «Хельсинкская декларация» (1996)). Все манипуляции проводились под общим наркозом, по завершении эксперимента животное декапитировали не выводя из состояния сна. Влияние раствора антикоагулянта оценивали после его введения в яремную вену. Лазер-индуцированный тромбоз моделировали на прижизненном препарате сосудов брыжейки тонкого кишечника, с видеофиксацией изменений. Для облучения XIV МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СТУДЕНТОВ, АСПИРАНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ «ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ НАУК» 32  Россия, Томск, 25-28 апреля 2017 г. Том 4. Биология и фундаментальная медицина    использовали полупроводниковый лазер (535 нм, 50 мВт), время воздействия от 30 до 180 секунд, диаметр светового пятна – 30-40 мкм. В качестве объектов воздействия выбирались артериолы и венулы диаметром 25-50 мкм. Во всех экспериментах сравнивали результаты с контрольной группой животных.  Статистический анализ данных выполняли методами вариационной статистики для малых рядов наблюдений. Статистическую значимость оценивали, используя U-критерий Манна-Уитни, значимыми считались отличия при значениях р<0,05. Результаты. В качестве сырья для получения антикоагулянтов использовали листья черники обыкновенной (Vaccínium myrtíllus). Сухое измельченное сырье экстрагировали гидроксидом аммония, полученный экстракт отфильтровывали, порции экстракта объединяли, концентрировали, отдиализовывали, недиализуемую часть высушивали. Полученный экстракт в Трис-НСl буфере (рН 7,2) в сравнении с контролем дозазависимо удлинял АЧТВ, ПВ и ТВ (рис.1). Наибольшую активно раствор экстракта черники угнетал АЧТВ (в концентрации 2,5 мг/мл эффективность торможения i 0,65). Последующее разделение экстракта провели гель-фильтрацией (Toyopearl HW-40, Fine колонка 500Х10 мм, элюент 0,25 мМ ацетатно-аммонийный буфер (рН 7,6)). Удалось разделить экстракт черники на 6 фракций, из которых наиболее активной оказалась фракция 1 (рис.2.).    Рис. 1. Зависимость эффективности торможения плазмокоагуляции от концентрации экстракта Рис. 2. Противосвертывающая активность фракций экстракта  После введения экстракта в кровоток крыс через 5, 30 и 90 мин осуществляли отбор проб крови, получали богатую и бедную тромбоцитами плазму, используя её для оценки АЧТВ и АТ. В течение времени наблюдения сохранялось выраженное (i=0,17±0,003) торможение АЧТВ. Также, в сравнении с контролем, на 14,4±0,1% снижалась интенсивность АДФ-индуцированной АТ, и на 15±2,3% повышалась деформируемость эритроцитов. При моделировании тромбоза индуцированного лазерным излучением фиксировали изменение скорости кровотока и диаметра сосудов микроциркуляторного русла. В контрольной группе уже на первых секундах облучения  наблюдалось увеличение скорости кровотока, а уже через 30 секунд скорость кровотока замедлялась и увеличивалась зернистость потока (рис.3). При увеличении продолжительности облучения до 90-180 секунд отмечалась вазодилятация и выраженная миграция лейкоцитов в зону повреждения (рис.4). В дальнейшем наблюдается адгезия и агрегация форменных элементов с формированием пристеночного тромба, а затем и полная остановка кровотока вследствие закупорки им сосуда (рис.5).   XIV МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ СТУДЕНТОВ, АСПИРАНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ «ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ НАУК» 33  Россия, Томск, 25-28 апреля 2017 г. Том 4. Биология и фундаментальная медицина       Рис. 3. Изменение скорости кровотока через 30 секунд от начала облучения (1 – нормальный кровоток, 2 – замедление кровотока). Рис. 4. Миграция лейкоцитов в очаг повреждения через 60-90 секунд от начала облучения. Рис. 5. Тромбоз сосуда через 150-180 секунд от начала облучения.  В сравнении с контрольной группой на фоне предварительного введения гепарина потребовалось увеличить время облучения до 360 секунд, полной остановки кровотока не наблюдалось, а гемодинамика восстанавливалась через 15 минут после прекращения воздействия. При предварительном введении животным исследуемого экстракта листьев черники продолжительность облучения, необходимая для нарушения гемодинамики, составила 300 секунд. По сравнению с контролем увеличилось время развития гемодинамических нарушений, снизилась скорость тромбообразования, а остановка кровотока была временной (восстановление через 12-18 минут).  Заключение. Полученные в ходе исследования результаты позволяют утверждать, что из листьев черники может быть получен антикоагулянт, выраженно угнетающий реакции внутреннего пути плазмокоагуляции в тестах in vitro и in vivo. Преимущественное влияние антикоагулянта на АЧТВ, и фактически исчезающее при разбавлении влияние на ПВ и ТВ свидетельствует о специфичном торможении активности факторов внутреннего пути плазмокоагуляции, однако точка приложения эффекта, а также детали механизма угнетения свертывания эффектором нами пока не уточнены. Продолжительность действия полученного антикоагулянта составляет не менее 1,5 часов, а его внутривенное введение не приводит к гибели животного. Как и официнальный прямой антикоагулянт – гепарин, исследуемый антикоагулянт снижает активность развития тромботических реакций при моделировании тромбоза. Кроме влияния на плазмокоагуляционный гемостаз, антикоагулянт ограниченно угнетает агрегацию тромбоцитов и повышает эластичность мембран эритроцитов, что позволяет говорить о его мембранопротекторных свойствах. Последнее утверждение требует детального исследования, в первую очередь – уточнения механизма наблюдаемых эффектов.  СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1 Русакова О.А. Растения флоры Сибири, как источники антикоагулянтов прямого действия // В сб.: Обмен веществ в норме и патологии. - Тюмень, 1992. - С. 84. 2 Губаев А. Г. Фармакологические свойства антикоагулянта прямого действия из травы нонея темная: автореф. дисс. канд. мед. наук. – Тюмень, 1996. – 20 с. 3 Дементьева И.А., Леонова О.П., Умутбаева М.К. Препарат противосвертывающего действия из медуницы мягчайшей //Молодежь – практ. здравоохранению: Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. мол. ученых. - М., 1990. - С. 42-43. 

Preparation and experimental efficiency mark of new direct anticoagulant

RWTH Publications

Befunde zum menschlichen Spiegelneuronensystem bei Autismus: Eine kritische Übersicht funktioneller Bildgebungsstudien

http://earchive.tpu.ru/bitstream/11683/44897/1/conference_tpu-2017-C21_V4_p31-33.pdf

Preparation and experimental efficiency mark of new direct anticoagulant

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Electronic archive of Tomsk Polytechnic University

RWTH Publications