Escribano, M. Isabel

Goñi Ramos, Óscar

Merodio, Carmen

Sánchez Ballesta, M. Teresa

Sánchez-Ballesta, M. Teresa

Digital.CSIC

Avances en poscosecha de frutas y hortalizasI. Recasens, J. Graell, G. Echeverría (editores)Edicions de la Universitat de LleidaLleida, 2012Proceedings.indb   5 20/09/2012   08:52:41DL: L-1.128-2012ISBN: 978-84-695-4683-3© Edicions de la Universitat de Lleida, 2012© del texto: los autoresMaquetación: Edicions i Publicacions de la UdLDiseño de portada: La GràficaImpresión: Service PointProceedings.indb   6 20/09/2012   08:52:41A continuación se relacionan unas erratas detectadas en el libro Avances en Poscosecha de Frutas y Hortalizas, I. Recasens, J. Graell, G. Echeverria (Editores), Edicions de la Universitat de Lleida (ISBN: 978-84-695-4683-3). Además, se presentan 2 nuevos capítulos que por error no aparecieron en el citado libro:•	 Biomarcadores de tolerancia a bajas temperaturas activados por altas concentraci-ones de CO2, de los autores: O. Goñi, M.T. Sanchez-Ballesta, C. Merodio y M.I. Escribano•	 Daños por frío en fruto de calabacín (Cucurbita pepo L.): comparativa de zonas dañadas y sanas de exocarpo, de los autores: V. López-Cadenas, F. Carvajal, M. Jamilena y D. GarridoBiomarcadores de tolerancia a bajas temperaturas activados por altas concentraciones de CO2O. Goñi1, M.T. Sanchez-Ballesta1, C. Merodio1 y M.I. Escribano1ResumenLa tolerancia al daño por frío viene determinada principalmente por la capacidad para evitar alteraciones en la estructura y conformación de las membranas celulares mediante cambios en la composición de las biomembranas y acumulación en el citosol de moléculas osmoprotectoras y crioprotectoras que actúan manteniendo el turgor y protegiendo las macromoléculas y estructuras celulares. En chirimoya (Annona cherimola Mill.), el tratamiento con altas concentraciones de CO2 por 3 días incrementa la tolerancia al daño por frío durante la conservación a bajas temperaturas. El análisis estructural por microscopía electrónica de barrido a baja temperatura reveló que los tejidos del mesocarpo de frutos tratados y conservados 9 días a 6 ºC muestran una estructura consolidada y mantienen la integridad de las membranas. En estos tejidos, además de la presencia de diferentes quitinasas y glucanasas, se observa la expresión diferencial de dos isoenzimas de baja masa molecular,	una	endoquitinasa	básica	de	14	kDa	y	una	1,3-β-endoglucanasa	glico-silada ácida de 19 kDa. El estudio funcional de estas proteínas reveló que, además de su actividad hidrolítica, presentan una alta actividad crioprotectora, siendo muy	eficaces	en	la	protección	de	proteínas	criolábiles	frente	a	la	inactivación	por	congelación-descongelación, no mostrando ser activas como antifúngicas frente a Botrytis cinerea. A su vez, los tejidos pretratados con altas concentraciones de CO2 incrementan los niveles de glicina-betaína, amina cuaternaria con función osmoprotectora y crioprotectora, durante el periodo de conservación a bajas tem-peraturas.	Considerando	el	patrón	de	acumulación	de	glicina-betaína	y	el	perfil	de	expresión de las proteínas crioactivas, los resultados obtenidos indican que estos pueden actuar como biomarcadores de tolerancia a bajas temperaturas al estar funcionalmente implicados en el mecanismo de defensa activa frente al daño por frío inducido por el tratamiento gaseoso.1. Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC), Departamento de Carac-terización, Calidad y Seguridad, José Antonio Novais 10, Ciudad Universitaria, 28040, Madrid, España. 8 O. Goñi, M.T. Sanchez-Ballesta, C. Merodio, M.I. EscribanoinTRODuCCiÓnLas plantas activan en respuesta al frío, uno de los principales estreses ambienta-les,	una	serie	de	genes	y	mecanismos	bioquímicos	y	fisiológicos	que	les	ayudan	a minimizar los efectos negativos del estrés por bajas temperaturas. Algunas de estas reacciones implican cambios en el contenido proteínas constitutivas o la síntesis de novo de péptidos y proteínas asociadas a la situación de estrés, entre ellas se hallan enzimas implicadas en el metabolismo de carbohidratos, en la modificación	de	los	lípidos	de	membrana	o	en	la	defensa	antioxidante	(Renaut	et	al.,	2006),	proteínas	anticongelantes	(AFP:	Griffith	y	Yaish,	2004),	proteínas	crioprotectoras como dehidrinas (Rorat, 2006) o proteínas relacionadas con la patogénesis (PRs: Van Loon et al., 2006). En general, las PRs se inducen de manera coordinada frente a la infección de las plantas por patógenos y en respuesta al tratamiento con etileno, sin embargo, se ha observado la expresión de quitinasas y glucanasas en ausencia de ataque por patógenos u otro estrés inductor, estando implicadas en procesos de desarrollo y crecimiento (Goñi et al., 2010). Asimismo, diferentes estudios han demostrado el	papel	protector	de	distintas	PRs,	principalmente	quitinasas,	1,3-β-glucanasas	y taumatina, en la aclimatación al frío presentando actividad anticongelante y/o crioprotectora	(Hincha	et	al.,	1997;	Griffith	y	Yaish,	2004;	Romero	et	al.,	2008).	Las AFPs presentan múltiples dominios hidrofílicos de unión al hielo inhibiendo su crecimiento así como la recristalización, por lo que disminuyen la formación de cristales extracelulares y evitan la formación de hielo intracelular y las pro-teínas crioprotectoras actúan protegiendo proteínas intracelulares y membranas del daño por bajas temperaturas y de la desnaturalización durante el proceso de congelación-descongelación. Estas proteínas además de actividad crioprotectora muestran	actividad	hidrolítica	y	antifúngica,	confiriendo	a	las	plantas	aclimatadas	más resistencia no solo al daño por congelación sino también al ataque por hongos.Estudios	 previos	 han	 establecido	 el	 efecto	 beneficioso	 de	 pretratamientos	 con	altas concentraciones de CO2 en chirimoya (Annona cherimola Mill.) al retrasar los daños por frío causados en este fruto por la conservación a bajas temperatu-ra (Merodio y De la Plaza, 1997; Maldonado et al., 2002). Aunque numerosos cambios bioquímicos han sido correlacionados con el aumento en la tolerancia al daño por frío aún no se ha establecido cual de ellos son adaptaciones a las bajas temperaturas y cuales desempeñan un papel funcional en la resistencia a la	conservación	a	bajas	temperaturas.	Ya	que	la	tolerancia	al	daño	por	frío	vie-ne determinada principalmente por la capacidad para evitar alteraciones en la estructura y conformación de las membranas celulares mediante cambios en la composición de las biomembranas y acumulación en el citosol de moléculas os- 9Avances en poscosecha de frutas y hortalizasmoprotectoras y crioprotectoras que actúan manteniendo el turgor y protegiendo las macromoléculas y estructuras celulares, en este trabajo hemos estudiado el patrón de expresión de biomoléculas crioactivas y osmoprotectoras implicadas funcionalmente en el mecanismo de tolerancia a bajas temperaturas activado por el pretratamiento gaseoso con altos niveles de CO2.maTeRiaL Y mÉTODOsChirimoyas (Annona cherimola Mill. cv Fino de Jete), procedentes de Almuñecar (Gra-nada),	se	mantuvieron	en	cámaras	de	respiración	de	20	L	en	oscuridad	a	6	ºC	bajo	flujo	de aire continuo o bajo tratamiento gaseoso (20% CO2 + 20% O2 + 60% N2). Después de 72 h de tratamiento gaseoso los frutos tratados fueron transferidos a condiciones de flujo	de	aire	continuo.	Periódicamente,	los	frutos	fueron	pelados,	eliminadas	las	semillas,	congelados en nitrógeno líquido y almacenados a -80ºC hasta su utilización.Las proteínas fueron extraídas con tampón acetato sódico 0.1M pH 5.0, conteniendo 1.5 % PVPP, 10 mM EDTA y 20 mM ascorbato sódico, fraccionadas y concentradas mediante ultrafiltración	y	precipitación	con	sulfato	de	amonio	(20-85%).	La	separación	de	las	frac-ciones de proteínas ácidas y básicas se realizó utilizando una columna de intercambio anió-nico Mono Q, unida a un sistema de FPLC (Pharmacia), a pH 8, siendo eluidas con NaCl 1 M. Las proteínas fueron separadas por electroforesis SDS-PAGE e inmunodetectadas utilizando	anticuerpos	anti-PR-Q	(quitinasa)	y	anti-PR-2	(1,3-β-glucanasa)	de	tabaco.	Las	proteínas	fueron	posteriormente	purificadas	por	cromatografía	iónica	y	cromatoenfoque.La actividad anticongelante se evaluará determinando la actividad de histéresis termal en los extractos proteicos mediante calorimetría diferencial de barrido, utilizando BSA como proteína patrón sin actividad anticongelante y una AFP glicosilada de pez ártico (Romero et al., 2008). La actividad criopotectora de los extractos proteicos fue medida siguiendo el método descrito por Lin y Thomashow (1992), usando BSA como proteína crioprotectora pa-trón. El valor DP50, concentración de proteína crioprotectora necesaria para alcanzar un porcentaje de actividad lactato deshidrogenasa (LDH) residual del 50%, se determinó representando semilogarítmicamente el porcentaje de actividad LDH residual frente a la concentración de la proteína.La actividad antifúngica de los extractos proteicos fue medida siguiendo el método descrito por Mauch et al. (1988), estimando la inhibición del crecimiento de las hifas de Botrytis cinerea. La concentración de proteínas utilizada en los ensayos de actividad antifúngica varió entre 60 y 300 µg, estando disueltas en tampón acetato sódico 20 mM, pH 5.5.10 O. Goñi, M.T. Sanchez-Ballesta, C. Merodio, M.I. EscribanoLa	glicina-betaína	fue	aislada	y	cuantificada	siguiendo	el	método	descrito	por	Storey	y Wyn-Jones (1977). Los niveles de peroxidación lipídica fueron estimados mediante la	cuantificación	de	malonildialdehido	por	el	método	del	ácido	tiobarbitúrico	(Ederli	et al., 1997).Los datos de tres repeticiones han sido procesados por ANOVA (Statigraphic program, STSC,	Rockville,	MD.)	para	un	nivel	de	significancia	P	≤ 0,05.ResuLTaDOs Y DisCusiÓn20El estudio del patrón de inducción de proteínas ácidas y básicas reveló que el in-cremento en la actividad crioprotectora parece estar asociado con la inducción por el tratamiento	gaseoso	de	una	isoenzimas	quitinasa	básica	y	una	isoenzima	1,3-β-glucanasa	ácida de baja masa molecular, 14 (BChi14) y 19 (AGlu19) kDa, respectivamente (Fig. 2).	La	caracterización	cinética	y	funcional	de	estas	proteínas,	tras	su	purificación	por	cromatografía iónica y cromatoenfoque, estableció su doble actividad, hidrolítica y crioprotectora, no presentando actividad antifúngica in vitro frente a Botrytis cinerea. Estas	enzimas,	una	endoquitinasa	básica	de	14	kDa	y	una	1,3-β-endoglucanasa	glicosi-lada ácida de 19 kDa, presentan una alta actividad crioprotectora con un valor DP50 de 6.4	µg/mL	para	la	quitinasa	y	de	8.7	µg/mL	para	la	1,3-β-glucanasa,	siendo	12.5	y	9.2	veces superiores al valor estimado para BSA (80.3 µg/mL). Los valores de actividad crioprotectora son del orden de aquellos descritos para otra familia de proteínas crio-protectoras muy activas, las dehidrinas (Bravo et al., 2003). Asimismo, al evaluar los niveles de glicina-betaína en el mesocarpo de frutos trata-dos y no tratados hallamos que aunque los frutos recién recolectados son capaces de sintetizar	esta	amina	cuaternaria,	sus	niveles	descienden	significativamente	durante	la	conservación	frigorífica,	sin	embargo	el	pretratamiento	con	un	20%	de	CO2 induce un progresivo incremento en los niveles endógenos de glicina-betaína alcanzando un máximo a los 9 días de conservación (Fig. 3). Estas biomoléculas crioactivas y osmoprotectoras pueden actuar manteniendo el turgor y protegiendo las macromoléculas y estructuras celulares en los frutos pre-tratados con altas concentraciones de CO2. El análisis estructural por microscopía electrónica de barrido a baja temperatura reveló que los tejidos del mesocarpo de frutos tratados y conservados 9 días a 6 ºC muestran una estructura consolidada y mantienen la integridad de las membranas (datos no mostrados). A su vez, la evaluación de la funcionalidad de la membrana en frutos tratados y no tratados reveló mayor nivel de peroxidación lipídica (un aumento del contenido en ma-lonildialdehido) en frutos no tratados lo que implica que el pretratamiento con altas concentraciones de CO2 mantiene la integridad de la membrana evitando su rigidificación	y	daño	por	efecto	de	las	bajas	temperaturas	de	conservación. 11Avances en poscosecha de frutas y hortalizasConsiderando	el	patrón	de	acumulación	de	glicina-betaína	y	el	perfil	de	expresión	de las proteínas crioprotectoras, los resultados obtenidos indican que estos pueden actuar como biomarcadores de tolerancia a bajas temperaturas al estar funcionalmente implicados en el mecanismo de defensa activa frente al daño por frío inducido por el tratamiento gaseoso.agRaDeCimienTOsEste	trabajo	está	financiado	por	la	CICYT,	Proyectos	AGL2008-02949	y	AGL2011-26742. ReFeRenCiasBravo, L.A., Gallardo, J., Navarrete, A., Olave, N., Martínez, J., Alberdi, M., Close, T.J., and Corcuera, L.J. 2003. Cryoprotective activity of a cold-induced dehydrin purified	from	barley.	Physiol.	Plant.	118:	262-269.Ederli, L., Pascualini, S. Batani, P. and Antonielli, N. 1997. et al., 1997). Photoinhi-bition and oxidative stress: effects on xanthophyll cycle, scavenger enzymes and abscisic acid content in tobacco plants. J. Plant Physiol. 151: 422-428. Goñi, O., Sanchez-Ballesta, M.T., Merodio, C. and Escribano, M.I. 2010. Ripening-related defense proteins in Annona fruit. Postharvest Biol. Technol. 55: 169-173.Griffith,	M.	and	Yaish,	M.W.F.	2004.	Antifreeze	proteins	in	overwintering	plants:	a	tale of two activities. Trends Plant Sci. 9: 399-405.Hincha, D.K., Meins, F. and Schmitt, J.M. 1997. b-1,3-Glucanase is cryoprotective in vitro and is accumulated in leaves during cold acclimation. Plant Physiol. 114: 1077-1083.Lin, C. and Thomashow, M.F. 1992. A cold-regulated Arabidopsis gene encodes a polypeptide having potent cryoprotective activity. Biochem. Biophys. Res. Com-mun. 183: 1103-1108.Maldonado. R., Molina-Garcia, A.D., Sanchez-Ballesta, M.T., Escribano, M.I. and Merodio, C. 2002. High CO2 atmosphere modulating the phenolic response associ-ated with cell adhesion and hardening of Annona cherimola fruit stored at chilling temperature. J. Agric. Food Chem. 50: 7564-7569.Mauch, F., Mauch-Mani, B. and Boller, T. 1988. Antifungal hydrolases in pea tissues. II. Inhibition of fungal growth by combinations of chitinases and b-1,3-glucanase. Plant Physiol. 88: 936-942.Merodio, C. and De la Plaza, J.L. 1997. Cherimoya. In: Mitra, S.K., editor. Postharvest Physiology and Storage of Tropical and Subtropical Fruits. Wallingford: CAB International p. 269-93.Renaut, J., Hausman, J.F. and Wisniewski E. 2006. Proteomics and low-temperature studies: bridging the gap between gene expression and metabolism. Physiol. Plant. 126: 97-109.12 O. Goñi, M.T. Sanchez-Ballesta, C. Merodio, M.I. EscribanoRomero, I., Fernandez-Caballero, C., Goñi, O., Escribano, M.I., Merodio, C. and Sanchez-Ballesta, M.T. 2008. Functionality of a class I beta-1,3-glucanase from skin of table grape berries. Plant Sci. 174: 641-648. Rorat, T. 2006. Plant dehydrins: Tissue location, structure and function. Cell. Mol. Biol. Lett. 11: 536-556. Storey, R. and Wyn-Jones, R.G. 1977. Quaternary ammonium compounds in plants in relation to salt resistance. Phytochemistry 21: 777-791.Van	Loon,	L.C.,	Rep,	M.	and	Pieterse,	C.M.J.	2006.	Significance	of	inducible	defense-related proteins in infected plants. Annu. Rev. Phytopathol. 44: 135-162.                       Extractos ácidos Extractos básicos CO2 Aire Fig. 1. Actividad crioprotectora en extractos proteicos ácidos y básicos pro-cedentes de frutos tratados y no tratados con un 20% de CO2 por 3 días durante la conservación a 6 ºC. 13Avances en poscosecha de frutas y hortalizas          BChi14 PR-Q PR-2 AGlu19 Days at 6ºC 0 3 5 9 14Fig. 2. Detección mediante inmunoensayo de isoenzimas quitinasa	y	1,3-β-glucanasa	inducidas	diferencialmente	en	frutos pretratados con un 20% de CO2 por 3 días. AireFig. 3. Cambios en el contenido de glicina-betaína y malonildialde-hido en el mesocarpo de chirimoya durante la conservación a 6 ºC en aire y bajo el pretratamiento con un 20 % de CO2 durante 3 días.

Biomarcadores de tolerancia a bajas temperaturas activados por altas concentraciones de CO2.

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