Reprogramación del polen y obtención de plantas doble-haploide de Capsisum annuum L.: Marcadores celulares y expresión de moléculas señalizadoras de estrés.

Abstract

Universidad: Complutense De Madrid Departamento: Genetica Fecha De Lectura: 11/04/2008 Dirección: Director: Maria Del Carmen Risueño Almeida Codirector: Pilar Sanchez Testillano Tribunal: Presidente: Benjamín Fernández Ruiz Secretario: Cristina Pardo Martín Vocal: María Ángeles Bueno Pérez Vocal: Óscar Visente Meana Vocal: José María Seguí SimarroEl polen es capaz de cambiar su proceso de desarrollo, reprogramarse y entrar en una nueva ruta denominada embriogénica, tras un tratamiento de estrés. Tras su reprogramación, la microspora comienza a dividirse simétricamente dando lugar a proembriones y embriones que posteriormente continúan su desarrollo Regenerando plantas haploides o doble-haploides. En este contexto, el cultivo de anteras es, hoy en día, uno de los métodos más eficientes para la obtención de plantas doble-haploides, de gran utilidad para generar nuevas líneas isogénicas y variedades, así como para Estudios genéticos y de mutagénesis. El pimiento (capsicum annuum l.) Es uno de los cultivos hortícolas más importantes desde el punto de vista Económico en españa, siendo éste el país con mayor producción de la unión europea. En esta tesis doctoral, un primer objetivo ha sido la obtención plantas doble-haploides a partir de cultivos de Anteras de capsicum annuum yolo Wonder var. B. Hemos optimizado los protocolos existentes (Mitykó et al.,1995), estudiando diversos factores tales como la correlación entre la morfología de los botones florales, el tamaño y la coloración de las anteras con antocianina y el estadio de desarrollo de las microsporas, así como diversos aspectos del cultivo in vitro y el tratamiento de estrñes inductor de la embriogénesis. Por otro lado, se ha llevado a cabo la caracterización celular de las primeras etapas de desarrollo hasta el estado de torpedo en la embriogénesis de microsporas de Capsicum annuum L. Se ha determinado el nivel de ploidía de las plantas procedentes del cultivo de microsporas, mediante citometría de flujo. Un segundop objetivo ha sido el análisis de distintos aspectos del proceso de reprogramación del polen a embriogénesis, concretamente la identificación de marcadores en etapas clave y la expresión de proteínas de estrés y señalizadoras.Un segundo objetivo ha sido el análisis de distintos aspectos del proceso de reprogramación del polen a embriogénesis, concretamente la identificación de marcadores en etapas clave y la expresión de proteínas de estrés y señalizadoras. Existe una estrecha relación entre las proteínas de choque térmico (HSPs) y el abandono de la ruta gametofítica hacia la embriogénesis. Hemos estudiado los cambios en la expresión y en la localización subcelular de dos proteínas de choque térmico, HSP70 y HSP90, en la ruta gametofítica y en varias etapas de la ruta embriogénica. Tras el tratamiento inductor se observó un gran aumento de la expresión de HSP70, y una traslocación al nucleolo de la misma; sugiriendo una función específicamente protectora de la maquinaria nuclear y reguladora de la expresión génica. Se ha realizado una caracterización celular y ultraestructural (gametofítico y embriogénico) secuencial de todas las etapas de los procesos de desarrollo, mediante el empleo de técnicas histoquímicas e inmunocitoquímicas específicas, para elegir las fases fundamentales de estudio donde aparecen las características celulares y funcionales diferentes. Ha sido objeto de especial atención la definición de marcadores celulares que caracterizan y diferencian los do programas de desarrollo del polen, el gametofítico y el embriogénico, y que indican los principales cambios de actividad metabólica que están asociados a la reprogramación del polen.Entre estos marcadores se han identificado los cambios en el tamaño y forma celular y nuclear, el patrón de condensación cromatínica, la organización funcional de la región intercromatínica y la arquitectura nucleolar, la población ribosómica y la densidad citoplásmica, la presencia y tamaño de gránulos de almidón y por último, la estructura y composición de las paredes celulares. Se ha analizado la expresión in situ de moléculas señalizadoras como las ERKs, P-MAPKs y LOX, encontrándose diferencias en su expresión y localización subcelular entre las microsporas que se reprograman hacia proliferación (ruta embriogénica) frente a las que siguen su proceso normal de diferenciación (ruta gametofítica). Asimismo se han detectado cambios en la composición de las paredes celulares en relación a los procesos de proliferación y diferenciación. Muchos de los anticuerpos empleados han resultado ser buenos marcadores que nos permiten identificar de forma temprana en el cultivo las microsporas que se reprograman e inician la proliferación (ruta embriogénica): mayor proporción de ERK y MAPK en núcleo, aumento de cuerpos de Cajal nucleares, expresi¿¿on de PCNA asociado a replicación y mayor proporción de pectinas esterificadas (marcadas por JIM7) en las paredes celulares; frente a las que siguen su proceso normal de diferenciación (ruta gametofítica): acumulación de almidón, mayor proporción de ERK y PMAPK en citoplasma, y de pectinas no esterificadas (marcadas por JIM5), xiloglucanos (XG) y ramnogalacturonano II (RGII) en las paredes celulares. Los resultados obtenidos aportan nueva información muy valiosa sobre los mecanismos que controlan el proceso de reprogramación del polen a embriogénesis en Capsicum annuum L, una especie de gran interés económico; información que puede ayudar a su explotación de forma más eficiente y a dirigir futuras estrategias en la mejora de este cultivo.Peer reviewe