Referencia OEPM: P8803769.-- Fecha de solicitud: 12/12/1988.-- Titular: Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC).Peer reviewe

Ballesteros Olmo, Antonio

Sinisterra Gago, José Vicente

Sánchez Montero, José María

Digital.CSIC

k19REGISTRO DE LAPROPIEDAD INDUSTRIALESPA~NAk11 N. de publicacion: ES 2 009 450k21 Numero de solicitud: 8803769k51 Int. Cl.4: C07K 17/12C12N 11/12k12 PATENTE DE INVENCION A6k22 Fecha de presentacion: 12.12.88 k73 Titular/es: Consejo Superior InvestigacionesCientcasDept. Qumica Organica,Universidad MadridSerrano, 117, Madrid, ESk45 Fecha de anuncio de la concesion: 16.09.89 k72 Inventor/es: Sanchez Montero, Jose Mara;Sinisterra Gago, Jose Vicente yBallesteros Olmo, Antoniok45 Fecha de publicacion del folleto de patente:16.09.89k74 Agente: Polo Sanz, Modestok54 Ttulo: Procedimiento de activacion de zuro de maz mediante sulfonacion para la insolubilizacionde ligandos y protenas.k57 ResumenSe describe la reaccion de activacion, mediantecloruros de sulfonilo, de zuro molido y sometidoa diversos tipos de lavado. El solido resultantequeda muy funcionalizado, siendo muy estableslos grupos sulfonato introducidos. Este solido ac-tivado es muy reactivo para insolubilizar en el li-gandos o protenas a traves de grupos amino y/osulfhidrilo de estas moleculas.Venta de fascculos: Registro de la Propiedad Industrial. C/Panama, 1 { 28036 Madrid1 2 009 450 2DESCRIPCIONLa jacion de moleculas a solidos -insolubili-zacion- (1) ha resuelto dos graves limitaciones quepara su utilizacion a escala industrial presentan,en principio, los enzimas nativos (solubles), per-mitiendo: 1) recuperar el biocatalizador para suposterior reutilizacion; y 2) aumentar su estabili-dad. Es por ello que en la mayoria de los procesosindustriales con biocatalizadores, estos se usen ensu forma insoluble.Aunque la jacion de moleculas a solidospuede ser de varios tipos, se preere la jacionpor enlace covalente por la mayor fortaleza dela union que se forma. El procedimiento masusado hasta ahora para insolubilizar moleculasconsiste en la activacion del solido (soporte) conbromuro de cianogeno (2). Este metodo, aunquesupuso un hito para el desarrollo de la bioqui-mica en fase solida, actualmente se emplea me-nos porque el enlace que se forma con la moleculano es muy fuerte (y esta puede separarse del so-porte), y ademas introduce una carga ionica ex-tra (3, 4). Por otra parte, un segundo metodomuy usado, el del glutaraldehido (5), requiere unelevado numero de pasos y el procedimiento es di-cilmente controlable y reproducible (6 y 7). Deentre los nuevos metodos de insolubilizacion demoleculas, uno de los que mas prometen actual-mente es el que emplea los cloruros de sulfonilo(8, 9, 10, 11), mediante el cual la union se realizaa traves de los grupos amino y/o sulfhidrilo de lamolecula: de esta manera, los enlaces formadosson muy estables y no introducen cargas ionicasadicionales.Como soporte se han usado solidos de muydiversos tipos, tanto organicos (polisacaridos, po-liacrilamidas, etc.) como inorganicos (silicatos,vidrios macroporosos, etc.). A la hora de ele-gir un soporte para utilizacion industrial se debenconsiderar muchos factores: posibilidades de fun-cionalizacion, propiedades mecanicas, resistenciaa la temperatura, precio, etc. En los trabajosde investigacion los soportes mas empleados hansido vidrios macroporosos y geles de agarosa, quesin embargo no son adecuados para aplicacionesindustriales principalmente por su precio, los pri-meros, y por su alta compresibilidad y poca re-sistencia termica, los segundos.En el estudio que venimos llevando a cabosobre nuevos soportes y metodos de insolubili-zacion hemos desarrollado un procedimiento deactivacion de zuro de maiz mediante cloruros desulfonilo. El zuro o carozo (corazon o raspa dela panoja del maiz despues de desgranada) es undesecho vegetal abundante que convenientementemolido puede servir como soporte. Es un mate-rial no poroso, muy duro y resistente a la com-presibilidad y a la temperatura, y -como todoslos materiales lignocelulosicos- muy resistente ala contaminacion microbiana.El metodo de funcionalizacion o activacion hasido el tratamiento con cloruros de sulfonilo me-diante modicaciones introducidas por nosostrosen procedimientos anteriores (9). De esta manerase obvian muchas de las dicultades apuntadasanteriormente referentes a soportes y a metodosde activacion. Los cloruros de sulfonilo reac-5101520253035404550556065cionan con los grupos alcohol primario de losazucares y tambien con los grupos fenolicos (de lalignina del zuro), consiguiendose una activacionde esta muy alta. Los sulfonatos obtenidos sonmuy buenos \grupos salientes", facilitando la pos-terior reaccion con moleculas que tengan gruposamino y/o sulfhidrilo. Este procedimiento tiene lapeculiaridad de que entre el soporte y la moleculaa insolubilizar se forma un enlace directo (tipoamina secundaria o tioeter), es decir, que no seintroduce ningun brazo conector procedente delreactivo utilizado en la activacion. Los ligandos yotras moleculas que por este procedimiento hemosinsolubilizado en zuro al que previamente habia-mos sometido a diversos tratamientos, poseen altaactividad, resistencia a la temperatura y magni-cas propiedades mecanicas.Los haluros de sulfonilo utilizables para acti-var al zuro son cloruro de p-toluensulfonilo, clo-ruro de bencesulfonilo, cloruro de tionilo, clorurode trifluoroetanosulfonilo.Los ligandos y sustancias proteinicas activasson aminoacidos, cofactores, antibioticos, hormo-nas, proteinas, enzimas, celulas (es decir, cual-quier molecula que posea al menos un grupoamino y/o sulfhidrilo).La invencion se ilustra con ayuda del procedi-miento y ejemplos siguientes:Para la activacion del zuro de maiz se pro-cedio, previamente, a la obtencion de acetonapura y seca (12).Ejemplo 1:Se pesa zuro de maiz (1 g) (con un diametrode particula de aproximadamente 0.8 mm) y se lea~naden (todas las cantidades en los ejemplos 1-9se dan por gramo de zuro) 50 ml de acetona puray seca y l g de p-toluensulfonilo (cloruro de to-silo, TsCl). A continuacion se a~nade lentamentecon agitacion 1 ml de piridina y se mantiene lamezcla en agitacion durante 20 h a temperaturaambiente. Seguidamente se ltra la mezcla porgravedad,lavando el soporte con 90 ml de acetonapura y seca, en dos porciones, una de 60 y otrade 30 ml.El grado de funcionalizacion del zuro de maizse determina realizando la hidrolisis alcalina (conNaOH 1 N; 24 h) del zuro tosilado y determinandopor especrofotometria UV ( 256.8 nm), la canti-dad de tosilatos liberados por la muestra. En estecaso el numero de grupos tosilato presente en elzuro de maiz fue de 86 moles/g de zuro.Ejemplo 2.Se toma 1 g de zuro y se realiza la activacionen las mismas condiciones que en el ejemplo 1,excepto que se a~nade 1 ml de etanolamina. Elnumero de grupos tosilo fue en este caso de 60moles/g de zuro.Ejemplo 3Se toman 0.5 g de zuro de maiz y se realizala activacion en las mismas condiciones que en elejemplo 1. El numero de grupos tosilo unidos alzuro es en este caso de 53 moles tosilo/g soporte.Ejemplo 4Se toman 0.5 de zuro de maiz y se realiza laactivacion en las mismas condiciones que en elejemplo 1 excepto que el tiempo de tosilacion fuede 1 h. El numero de grupos tosilo unidos al zuroes en este caso de 10 moles tosilo/g zuro.23 2 009 450 4Ejemplo 5Se realizo la tosilacion del zuro en condicio-nes analogas a las del ejemplo 3 pero el tiempode tosilacion fue de 9 h. El numero de grupostosilo unidos al zuro es en este caso de 40 molestosilo/g zuro.Ejemplo 6Se pesa zuro de maiz (2 g) y se le a~naden (porcada g) 20 ml de agua destilada, agitandose lamezcla durante 24 h a temperatura ambiente. Se-guidamente se ltra el solido, recogiendose un l-trado amarillento, que se desprecia. El solido selava con 2 x 30 ml H2 0 y despues con 2 x 30ml de acetona pura y seca. El solido tratado sesomete a las condiciones de tosilacion indicadasen el ejemplo 1, pero el tiempo de tosilacion fuede 24 h a temperatura ambiente. El numero degrupos tosilo unidos al zuro fue en este caso de 34moles tosilo/g soporte.Ejemplo 7.Se toma zuro de maiz (2 g) y se le a~naden 20ml de HCl 0.1 N, agitandose la mezcla durante 24h a temperatura ambiente. Seguidamente se l-tra el solido, recogiendose un ltrado ligeramenteamarillento, que se desprecia. El solido se lavacomo en el ejemplo 6 y se tosila durante 24 h enlas condiciones del ejemplo 1. El numero de gru-pos tosilo unidos al zuro es en este caso de 26moles tosilo/g soporte.Ejemplo 8Se trata zuro (2 g) con 20 ml de tampon 0.1N carbonato-bicarbonato, pH9, durante 24 h atemperatura ambiente. Seguidamente se ltra lamezcla recogiendose un ltrado amarillo intenso,quedando el solido de color amarillo claro. Elsolido se lava como en el ejemplo 6 y se tosiladurante 24 h en las condiciones del Ejemplo 1. Elnumero de grupos tosilo unidos al zuro en estecaso es 26 moles tosilo/ soporte.Ejemplo 9Se trata zuro de maiz (2g) con 20 ml de NaOH1 N durante 24 h a temperatura ambiente y conagitacion. Seguidamente se ltra la mezcla re-cogiendose un ltrado rojizo y un solido blancoamarillento. La destruccion del solido es evidentepues de los 2 g de partida solo se recogieron 0.6 g.El solido se lavo como en el Ejemplo 6 y se tosilodurante 24 h en las condiciones del Ejemplo 1. Elnumero de grupos tosilo al zuro es en este caso 41moles tosilo/g zuro de maiz (peso nal).Utilizacion de los derivados tosilados de zuro demaiz en la inmovilizacion de Proteinas y otrosligandosA n de comprobar que nuestros derivados to-silados de zuro de maiz eran utiles para la insolu-bilizacion de proteinas y ligandos, se procedio ainsolubilizar: A) endonucleasa de Staphylococcusaureus; y B) lisina.A) La inmovilizacion de endonucleasa se rea-lizo segun un metodo similar al descrito por no-sostros previamente para el caso de agarosa to-silada (11). Estos derivados se utilizaron en lahidrolisis de DNA desnaturalizado. Algunos delos resultados obtenidos, prueba de la validez delmetodo para el caso de insolubilizacion de macro-moleculas proteinicas, se dan a continuacion:5101520253035404550556065A B C DR-2 | 58 45R-HCl HCl 0.1 N 92 45R-H2 0 H2 0 85 45R-NaOH NaOH 1 N 68 45R-CO3 Na2 CO3 / 82 45NaHCO3pH = 9.0SiendoA = MuestraB = TratamientoC = %DNA hidrolizado (3h)D = T de hidrolisis (C)B) Union de lisina al zuro tosiladoEjemplo 10:A 0.5 g de soporte R-HCl (zuro que habia sidolavado con HCl y tosilado despues) se le a~naden10 ml de tampon Na2CO3 /HaHCO 0-1 M, PH 9-0, y 0-1891 g de lisina; y se agita durante 90 mina temperatura ambiente. Seguidamente se ltray lava con 5 ml del tampon. La cantidad de li-sina ligada se determino por diferencia, midiendo-mediante dinitrofluorobenceno y utilizando cro-matograa liquida de alta presion- la lisina queno se habia unido al soporte activado. En esteexperimento se unio el 24 % de la lisina a~nadida.Ejemplo 11:Igual que el ejemplo 10 pero el tiempo dereaccion fue de 24 h. La cantidad de lisina unidafue del 27 %.Ejemplo 12:Igual que el ejemplo 10 pero con 0.3782 g delisina. El 16.5 % de esta quedo ligada al soporte.Ejemplo 13Igual que el Ejemplo 10 pero con 0.3782 g delisina. La cantidad de lisina unida fue del 30 %Biblioqraa1. K.Kosbach, (ed.) Methods in Enzymology, vol 44 (1976)2. R. Axen, J. Porath & S.Ernback, Nature214, 1302 (1967).3. M. Wilcheck, T.Oka & Y.J. Topper, Proc.Natl. Acad. Sci.USA. 72, 1055 (1975).4. J.Kohn & M. Wilchek, in W.H. Scouten(ed.), Solid Phase Biochemistry, Wiley, NewYork, 1983, p. 599.5. P.D. Weston and S. Avrameas, Biochem.Biophys. Res Commun. 45, 1574 (1971).6. P. Monsan et al., Biochimie 57, 1281 (1975).7. M.S. Casero y J.V. Sinisterra, observacionessin publicar.8. T.C.J.Gribnau, Tesis Doctoral, Universidadd Nijmegen (Holanda), 1977.9. K. Nilsson and K. Mosbach, Eur. J. Bio-chem. 112, 397 (1980).35 2 009 450 610. W.H.Scouten and W. van der Tweel, enAnity Chromatography and BiologicalRecognition, Eds. Chaiken, M. Wilchekand I. Parik, Acdademic Press, New York1983, p 299.11. A. Ballesteros, J.M. Sanchez Montero and5101520253035404550556065J.V.Sinisterra, J. Mol. Cat. 38, 227 (1986).12. A.I. Vogel, A. Textbook in Practical OrganiChemistry, Longmans New York, 3a. ed.,1974, p. 17l47 2 009 450 8REIVINDICACIONES1. Procedimiento de activacion de zuro demaiz mediante sulfonacion para la insolubili-zacion de ligandos-y protenas caracterizadoporque el zuro se muele y tamiza hasta tama~noadecuado, se trata con acetona pura y seca, y sea~nade un cloruro de sulfonilo y posteriormentepiridina o aminas alifaticas, manteniendose lareaccion en agitacion a temperatura ambiente du-rante 20 h; transcurrido este tiempo se lava conacetona pura y seca siguiendo el procedimientodescrito por nosotros para geles de agarosa; unavez obtenido el solido activado, puede procedersea la jacion de la molecula de que se trate obien ser almacenado largo tiempo antes de rea-lizar la jacion; durante este almacenamiento nose pierde su capacidad de insolubilizar moleculas.2. Un procedimiento segun reivindicacion51015202530354045505560651 caracterizado porque el tiempo de reaccionpuede estar comprendido entre 1 y 48 horas.3. Un procedimiento segun reivindicacion 1caracterizado porque el solido, antes de proce-der a su activacion, se somete a una extraccionprevia con agua destilada a temperatura ambientedurante 24 h., se ltra y se lava con agua y conacetona.4. Un procedimiento segun reivindicacion 1caracterizado porque el soporte se somete a unaextraccion previa con HCl durante 24 h a tempe-ratura ambiente, se ltra y se lava con agua y conacetona.5. Un procedimiento segun reivindicacion 1caracterizado porque el soporte se somete a unaextraccion previa con solucion tampon durante 24h a temperatura ambiente, se ltra y se lava conagua y acetona.5

Procedimiento de activación de zuro de maíz mediante sulfonación para la insolubilización de ligandos y proteínas

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