Synthèse de dérivés glucosylés du 1,5-anhydro-D-fructose à l'aide de glucane-saccharases natives et recombinantes

Abstract

Le développement d’un procédé de synthèse de l’AF catalysée par l’-(1,4) glucane-lyase rend\ud aujourd’hui la molécule facilement accessible à partir d’amidon. Sa valorisation fait l’objet du projet\ud européen NEPSA auquel sont intégrés mes travaux de thèse. Ils sont focalisés sur la synthèse de\ud dérivés glucosylés de l’AF à l’aide de glucane-saccharases (GS). Ces enzymes catalysent à partir de\ud saccharose le transfert d’unités glucosyle sur des molécules exogènes dites acceptrices.\ud Pour la première fois, il a été démontré que l’AF est reconnu comme accepteur par les GS\ud produites par des souches de Leuconostoc mesenteroides et Neisseria polysaccharea. Les produits de\ud glucosylation sont des anhydro-D-fructo-glucooligosaccharides (AFGOS) résultant de transferts\ud successifs d’unités glucosyle sur l’AF. Des familles d’AFGOS de structures différentes peuvent être\ud synthétisées par l’utilisation de GS de spécificités distinctes.\ud Les AFGOS produits par la réaction d’accepteur conservent un fort pouvoir anti-oxydant mais sont\ud dépourvus de propriétés prébiotiques. La réactivité particulière de l’AF a également été mise à profit\ud pour la dérivation quantitative, spécifique et rapide de l’AF et des AFGOS en oximes.\ud La production des AFGOS a été optimisée en contrôlant le rapport molaire saccharose/AF et la\ud matière sèche pour atteindre des taux de conversion compris entre 50 et 80 % selon la GS utilisée.\ud D’autre part, l’utilisation de variants de GS obtenus par ingénierie rationnelle permet d’améliorer\ud encore la glucosylation de l’AF. Pour isoler de nouvelles enzymes plus efficaces par criblage de\ud banques de variants générés par ingénierie combinatoire, une méthode basée sur la réduction\ud spécifique de l’AF a été développée.\ud The development of the of 1,5-anhydro-D-fructose (AF) production from starch catalysed by -(1,4)\ud glucanlyase makes now AF easily available. Its valorisation is currently the subject of the NEPSA\ud european project in which my thesis work is involved. This work is focused on the synthesis of AF\ud glucosylated derivatives with glucansucrases (GS) which catalyse the transfer of glucosyl residues\ud from sucrose to an exogenous molecule named acceptor.\ud We have demonstrated for the first time that AF is recognized as an acceptor by the GS from\ud Leuconostoc mesenteroides and Neisseria polysaccharea strains. The glucosylation products are\ud anhydro-D-fructo-glucooligosaccharides (AFGOS) which result from successive glucosyl transfers to\ud AF. Several AFGOS families of different structures are obtained owing to the specificity of the GS\ud used.\ud AFGOS present an anti-oxydant power as high as AF but no prebiotic effect. The reactivity of AF\ud was also studied in the case of oxime derivatization, and we developed a fast, quantitative and specific\ud conversion of AF and AFGOS.\ud Last, the production of AFGOS was optimised thanks to the control of the sucrose/AF molar ratio\ud and the total sugar concentration, thus reaching conversions comprised between 50 to 80 % owing to\ud the GS employed. In addition, the use of GS variants constructed by rational engineering enabled the\ud further increase of conversions. In order to isolate new enzymes improved for AF glucosylation and\ud which are generated by combinatorial engineering, a specific screening method based on the specific\ud AF reduction was developed