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三浦, 真希子

原, 登久子

大和田, 国夫

平井, 和子

石沢, 里美

Osaka City University Repository

大阪市、工大学'U，fjf;f宇都紀要・ ?i29巻 (1981) -9 -
高速液体クロマトグラフィ ーによる食品中の
トコフエロール同族体の定量法の検討
平 井和子，石沢哩美， 三 浦真希子 ，原登久子 ， 大 和田国夫
Tocopherol Al1alysis in Foodstuffs 
by High-Performance Liquid Chromatography 
KAZUKO HJRAI， SATOMI ISHIZAWA， MAKIKO MIURA， TOKUKO HARA， KUNIO OWADA 
序論
Jl'in加を代刈や.t化I;)jIiに!日jtJするビタミン Eの必決121
は s丸山'1;飽千Il JIl'í ij)j般の~!t l(i :，1:に官般にl見l辿しているよと
がiリlらかにされているが1，.f~IEI ではその・必波ー 日 i， 1).j6時に
iEめりIlてむらず.JU![なれtl[，(:，( b '1;1)1である。ビタミ
ン Ej!り[i:止を t巴j~・するために !i ， ftM，'l'のビタミン E合
l止を求めるよとが必吹:であるが.総てのtU，Iに過するt:i
'1定 :，;:i1;b 6i在u:;されていない。またピ7ミン EI'付制本!i.
a-，β・，y-， o-トコフエロール浮の!lH'1体をイjL. 作 々の I~
.flIU，ri刊.由、 y~なる 1)分泌Jヒ l，tを行・}必裂がある。これらト
コフエロールI"J}jU本の分勝Ai止法として，:'j;主液体7ロ7
ト7ラ7ィー(トIPLC)か. iÕ.~ /M 7ロマト 7ラフィーやガ
スクロマ トグラ 7 ィーよりも{愛れているニとカr判l.:へーされ
ている 21。そニでJ是々はまず HPLC によるトコ 7~ ロール
l' iJ 肢体の分繰í~ :，1法を卜fl々験，j.tし<人に総ての食，IJ，に)1，
j凶にJlI\ ・られるビタミン Eの~!ú .'l\)j i去を6官、工する II((Jて:
多くの食品について ~dl ll\ 粂 ('1 を比較険J した その結*
食品'1'のビタミン E州11¥粂1'1とトコフェロールドiJ)jU，j-;を
和l支よく分荷量する )j法を舷_'Lしたので報;りする。
実 験方法
1.試薬
際il'，a・.βー，y・，o-の れ トコフエロール(Toc)は 1本
分析セン 7ーより分与されたものをmぃ. 1付fff\~iV，物伐
としてJlJ¥、た2，2， 5. 7. 8・Pcntamethyl6-hydroxy chl'oman 
(Chro)!i Smithの )j法引によリ介成した。光収舟1)のLichro-
sorb !i Merckよリ .LS・111はlUi下作j七よりl他人L.エ
チルエーテルおよびヘキサンは l 級.J\:集を IIP~~I して 111
い.1血の"式集はけiHI.i ，¥1を11~、た。
2.高速液体クロマ トグラ フィー(HPLC)
，:'jfEポン7!ill‘1:633をJlIい.検Hla詰として U立203蛍
光;ぅj 'Jí:. 光!丸ìIをJr)\、て以ドの ~('I によリトコフエロ ル
lulb主体の分離〉じはを行った。
分析条1'1
カラム 4mmi.d.X250mm 
光明月1): L ichrosorb SI -60( 5μm) 
ft動fI: n・ヘキサン ・イソフロパ/ール(100: 0.2) 
，nt j!l: 1.8ml/min. 
検 ，'1¥ : ~ílJ起波 lと298nm. 蛍光被1~325nm
光 7閉じ キセノンランフ
3.脂質画分の抽出方法
ldll¥にJlI、、た"見事十は.1，'，1引tU，Iのf4JfTは40メ I -'ュ以
|、に粉砕し粉砕11¥~とない tt " II'， li 制11 かくl;IJ リ . Mf'I'後itlt
砂を}JIえてI'f.併した ilt{~食品.J\料は粉砂え li 紺lかく切
っ た fUII" を 車内符後 i キサーでl~主的 ilt{~ し，i1Ij裂した 。
a. 7ロロホルム ・ノタノール法(C'M法}
mt'，'O g相l勺:1;の"Af'1を精科・し.51青山の 7ロロホルム
.メタノール(2・I) i1tit>(J，i.びIl'iC'tlg吋たリO.2gのビ口市
ロールをIJI.:i...宅素ウえを充'.riL. 10分11俊枠後 .ti(}j'i 
目した。(以 1;総てのぬ1は宅業がえ充狽下て寸!った)旬
H 11l.'lIilJt銃f村山t'Bを行い. ili件1を紛:き， ~主i売に 5f:t. ~tの
7ロロホ Jレム ・メア/-1レiW&を}JIえ. 1，.IMlにi¥ttド111.'1¥
を行った。 51"1 tdl.'1¥を絞リj弘し. それらの泌1Mlhi分.Hs
め. I暗:過後キ'.;30-50mf に減， ，'.i~針ìL. ‘5・l，tのヘンゼンを
加えて1，1，.'1¥を 5lul-i Jった ヘンセンl('jをtめ， I存自民を『岐
!王制LL. 月甘 "'Clllli分を í~~た 。
b.然ベンゼン法
脈'('eJg判l勺loiのよ料を給停L. 5 f古川のベンゼンとIJl'i
'tlgあたりO.2gのヒロガロールを}JIえ. 1 0~jli:Híljl後
{主 J!I. ;r，: した。 判 Hj遺 ilotj~~ J~I i!ifをつけ沸胸i.l，;浴中て 11.¥'11
j51iAWl.' 1¥をfった。11/1iを if'i. 1併を除き . 伐ì~!ニ 5 f庁:"1C1)
ヘンゼンを}JIえ. 1 IJ与1:lj;Iift，Jd11¥i-~ i-た l，oHJに 51"1
1111¥を縦リi弘L.j'従!併を集め.ilj白後がJ30-50mfに減11:
???
? ?
収率として用いた。又， E含量の計算には内部様車事物質
に対する各 トコフエロール同族体の補正係数 (ピー ク面
積比)を用いた。
物食一10-
β 
1.高速液体クロマトグラフィーによる 卜コフエロール
同族体の分隊定置
充填剤として Lichrosorb 51・60(5μm)， Lichrosorb 
51-100(5μmと10μm)，L5・111を用いて種司の洛出条
件を試み， トコブエロール伺族体とChroのHPLCによる
分荷量条件を検討した。その結巣充療剤としてLichrosorb
5I・60(5μm，4mmi.d. X 250mm)を用い， n・ヘキサ ン ・
イソプロパノール(100:0.2)て1容出を行った場合に最も
良好な結果を得た(図ー 1)。又，Chroがトコフエロール
同族体と分離分析出来ることから.上記の条件下において
内部標準物質として係府出来ると恩われる。それぞれの
ピーク面積を求め，検量線を作成したところ.図-2に
示すよ うに原点をi通る直線が得られ，0.1-1.0μgの範
囲で精度よく トコフエ ロール同族体の分餓定量分析が出
来ることがわかった。
2.脂質始出方法の検討
食品中のビタミンE含量を測定する場合，まずビタミ
ンEを含む脂質問分を抽出し.けん化によってエステル
型のEを遊離型にした後日PLCにより分離分析が行われ
ている叱試料を直接ヘキサ ンにj容解後HPLCで分析され
ている食用油51や，脂質画分の州出操作を行わずI直被けん
化されている香辛料刷等を除き，一般的には食品からビタ
ミンEを含む脂質商分を抽出することが必要である。開
質問分の抽出溶媒としてウニ71や魚知町に熱ベンセ'ンカヘ
卵賞引にはク ロロホルム ・メタノ-/レ(l: 1)混ili:が，玄
米l引にはアルコールが，大豆111や野菜・果物121にはアセ
トン及びクロロホルム・メタノ ール(2: 1)混液の組合せ
果結験実
8 
〕し
Chromatogram of tocopherols and 
chro. 
T 
10 
Retention 
chro 
トー--J、.J¥"，，_J 
図-1
α 
。
』???????
???????』
? ? ?
α 
β 
7 
8 
chro 
??
?
?
6.0 
. g 
u 
帽
ミ包
.1‘ g 
帽.借凶
Q. 
1.0 
5tandard curves of tocopherols and 
chro. 
0.4 0.6 0.8 
Tocopherol (pg) 
0.2 。
図-2
(2) 
濃縮し.等景のベンゼンを加えて抽出を 5回行った。ベ
ンゼン層を集め.溶媒をi減圧留去し，脂質画分を得た。
c. 7ロロホルム・メタノール法と熱ベンゼン法の組
合せ法(C. M/熱ベンゼン法)
脂質19相当量の試料を精幸子し，クロロホルム・メタノ
ール法で2図抽出を行い.液!習を除き.残i査について熱
ベンゼン法で3回抽出を行った。 5回の州出液をlおめ，
前述同様に操作し，溶媒を減圧留去し，n旨質問分を得た。
4.けん化
脂質19につき 5%ピロガロ-/レ ・エタノ-/レ溶液4mC
を加え，沸鳩i易j容中で20秒娠と う後， 60%KOH水溶液l
mCを加え， 10分間還流し.けん化を行った。水冷後，エ
タノ-/i，-濃度が30%になるように水8.3mt を加えペ 30m~
のエチルエーテルで振とう総を用いて 5分間抽出を行っ
た。その後3000rpmで5分間遠心分離を行い，エチルエ
ーテル層を除いた。同様にして繰リ返し 3回エチルテー
テル抽出を行L勺それらのエーテル層を集め20mtの水を
加えて水j習がアルカリ性を示きなくなるまで数回水洗し
た。次にエーテル層をで硝て・脱水後減圧留去し，件られ
た'1くけん化物をヘキサ ン溶液とし， HPLCR式料とした。
5.定.爆作法
的f~の方法に従いビタミン E を含む脂質函分を食品か
ら抽出し.けん化を行った。不けん化物を抽出後一定量
のヘキサン溶液とし，高速液体クロマトグラフで分離分
析を行った。なお，試料をけん化後内書目標準物質(Chro)
を添加し，その凶収率を求め，その値をビタミ ンEの問
'il井他 :HPLCによる食品中のトコフエロール同族休め定量 -11-
表一 1 Efect of Solvent in Tocopherol Extraction from Foodstuff. 
Samp1e Solventa 
Tocophero1 Content (同/100g)
l1' β Y δ Tota1 
CM/Benzene 155 12 13 180 
Rice CM 133 9 12 154 
Benzene 163 12 14 189 
CM/Benzene 364 364 
Sweet Potato CM 286 286 
Benzene 186 186 
CM/Benzene 267 267 
Tuna CM 86 86 
Benzene 19 19 
CM/.Benzene 22.6 1.5 24.1 
Onion CM 15.1 1.0 16.1 
Benzene 12.7 1.1 13.8 
a CM means the method of extraction with chloroform-methanol (2: 1) and CM/Benzene means the com-
bination method of extraction with chloroform-methanol folowcd by extract ion with benzene. 
法が問いられている。しかしながら，それらの食品につ
い て浴媒による州出'tiの比較検"t~はされて お・らず. そ
れらの食，Il，からの Et自Iilに紋~な i容媒かど うかは不明で
ある.ビタミ ンE小fiU会IJ.， '1'(ムギ ・コムギ ・ダイえ
からのEl自lLHせを然ベンゼン法とクロロホルム・メタノ
ール(2:1) i昆波法と微分解法の3it・について.比較検討
し.熱ベンゼン法と 7ロロホルム ・メタノール(2:1)悦
討を法が脂質画分の州市にi直していると 報告しているへし
かしながらその他の食品についての報告はされて必らず.
食品中のビタミンE定地に過する州tH}j法の舵伝が必裂
であると忠われる。そこで今l叫はすべての食品に共通に
用いられる抽出方法を確立する1的で.pbj法を組合せた
力法(C. M/熱ベンゼン法)について検討を以みた。
a. 'p.-食品について
日本食品成分永を参Aちにして.食品鮮が異なる米.さ
つまい も，ま ぐろ.たまね ぎについて 3法を用いてビタ
2ンEを抽出し.定位を行った。その給*褒ー lに示し
たように.水分合iil:の少い:+とでIJ.，熱ベンゼン法がC'M
法よリもビタミ ンE州市誌が~<. C' M/然ベンゼン法
IJ.'i'IlIl(IJな他であ った。水分の多L、他の食品では， C'M 
/然ベンゼン法による抽出i誌がJド坊に多かった.すなわち
食品~fの 民なる 4 食，IA に|剥 して . C'M/熱ベンセン法に
よる州l1i置は他の州市方法と比較して良好か又はそれほ
ど庄が認められなかったことから判断して.以卜の食品
からビタ ミンEを州IHするJt:il自のfi法としてC'M/然べ
(:l) 
ンゼン法が最通であることが明らかとなった.
b. i~~合食品について
食，. .ttfの'J4なる 4食品について， C'M/J熱ベンセ'ン法
が共通法として胤いられる可能性が得られたが. より多
くの食品からの捕IllJi法として過 しているかを検討.する
為に泌介食品から の E を州出し 3 方法の給見~を比絞し
. ~。
ぷ料として.総ての食品群をー定の常1)合で含むような
食品を混合する U 自ので. 昭和52年度同氏栄~凋作成績131
を参考にして l人1(1分の平均的献立.を作成し.その l
日分の献'L梼成生食品混合物をJ日、、た.すなわち.各々
30， 29.及び27傾mの食品からh)e;る3例の献立 (合計食品
54filì~l()について trtlllH止の比較を行っ た。その紡*"-2
に示したようにC'M/熱ベンゼシ法が他の2法に比べE
J自1¥散が舷も多かった。 このことは. C'M/熱ベンゼン
法で州市した場介に.mいた54附矧の食品に|測して平均
的ビタ ミンE抽出呼fが紋も向い というニとを-&.わしてお
り，総ての食品について共通にI1JいられるE船出法の可
能代が外られた。
考 察
i高速ifH本のク ロマトグラフィー由、情造類似物質の分離
定 日;法として優れていることが示さ れ， ビタミンE同族
体の分離定量法むH.々の条件で検討さ れているlt他払
HPLCIH主;丘や充城剤が高価であることが多いが.著者
一12- 食 物 学
表-2 Effect of Solvent in Tocopherol Extraction from Composite Foods. 
Composite Foodsa So1ventb 
? 、? ??、?、?????
?
? 、
?
?
?
?? ??
?
?
??
??
CM/Benzene 
11 CM 
Benzene 
CM/Benzene 
111 CM 
Benzene 
Tocophero1 Content (~g/100g) 
α β γ δ Tota1 
210 29 274 39 552 
197 28 264 37 526 
148 28 197 30 403 
292 30 245 89 656 
180 28 195 69 472 
98 12 160 67 337 
148 13 204 18 383 
104 11 181 18 314 
95 13 152 13 273 
a Mixture of more than 27 kinds of foodstufs that fit food intake per capita per day in Japan in 1977. 
b CM means the method of extraction with chloroform-methanol (2: 1)and CM/Benzene means the com-
bination method of extraction with chloroform-methanol followed by extraction with benzene. 
らが組合せて用いた高圧ポンプや分光蛍光光度計は比較
的安価であり， 一般的に使用出来ると思われる。又， ビ
タミンE同族体の分離に最も良好な結果を得た Lichrosorb
SI-60は比較的価絡が安し利用価値があると思われる。
食品によって異なるが， HPLCを行った際にビタミン
E同族体の位置附近に数種類のピークが認められ，保持
時聞から判断閤維な場合には標単ビタミ ンE同族体を
HPLC試料に添加し，増加したピークからビタミンE同
族体の位遣を再確認した。それらの未知ピークはフロリ
ジルカラムや中性アルミナによる処理では除去出来ず，
ビタ ミンA，β・カロチン， ビタミン 0， ビタミンK，コ
レステロール類1;1殆んど蛍光定盆を阻害しなかった1日こ
とより，それら以外の食品由来の未知の蛍光を有する物
質のi昆在が考えられる。市販のエチルエーテルに含まれ
る抗般化剤はβと7・トコフエロールの中間に洛出される
ので.エチルエーテルを蒸留して混在する抗般化~J を除
去する必要があると恩われる。
抽出万法により食品からのビタミンE抽出盈に差が認
められたが，それらは食品に含まれる水分や脂質含量や
組織の差等食品の性質により異なると考えられる。特に
水分含量に関しては，水分の少い食品では熱ベンゼン法
が，水分の多い食品ではC.M法カ鳴い抽出率を示す傾向
が見られた。従って水分の多い食品の場合，組合せ法に
よって， まずクロロホルム・メタノールj昆液で水分を抽
出除去後ベンセ'ンで処理すると組織からのビタミンE嫡
出が容易になるように思われる。混合食品の場合，抽出
時における水分含量は70%以上ではあるが，個々の食品
については 0%(油)から96.2%(きゅう り)まで水分含量
に差が見られるにもかかわらず， C.M/熱ベンゼン法を
用いた場合に最も他出量が高かった。 この嫡出率の差
は，組織内の水分含量に依存するのか，抽出時における
水分含量によるのかは不明であるが.今後凍結乾燥食品
との比較により明獲になると思われる。
要 約
高速液体クロマトグラフィーによるビタミンE間接体
の分離条件を検討した結来.充填剤として Lichrosorb
SI -60(5μm， 4mmi.d. X250mm)を用い， n-ヘキサン・イ
ソプロパノール(100:0.2)で溶出した場合に良好な結果
を得， 0.1-1.0μgの感度で精度良〈蛍光定量することが
出来た。
食品からのビタミンE抽出を，クロロホルム・メタノ
ール法と熱ベンゼン法及びクロロホルム ・メタノーJレ法
で抽出後ベンゼンで抽出を行う組合せ法の 3法について
比較検討した。その結果，多くの食品に関 して組合せ法
で抽出した場合に最も良いビタミンE抽量を示し，総て
の食品に共通に用いられる抽出方法として利用出来る可
能性を得た。
謝 辞
種q御助言いただきました村田希久教授，内部標準物
質の合成等につきまして御指導いただきま した五十嵐筒
先生.機荷量α.β，Y， 8，各トコフエロール同族体を分与く
ださいました日本分析センタ一大阪支所の水瀬良友支所
(4) 
平井他:HPLCによる食品中のトコフエロール同族体の定量 -13-
長に厚くお礼申し上げます。
本研究の一部は第52四日本家政学会関西支部研究発表
会において発表しました。なお本研究の一部は文部省科
学研究費補助金(一般研究D.代表者平井和子)によ って
行ないました。
文 献
1 ) Harris， P.L. and Embree， N. D. : Am. ].Clin. Nutr.， 
13. 385-392(1963) 
2 )脂溶性ビタミン総合研究委員会 ・ビタミンE小委只
会:ビタミン.51. 373-380(1977) 
3) Smith， L. 1.， Ungnade， H. E.， Hoehn， H. H. and 
Wawwnek， S. :]. Org. Chem.， 4. 315-317(1939) 
4 )原 京子，石黒弘三.i勇口泰昌:栄養と食地.29. 
235-250(1976) 
5 )阿部精一，勝井五一郎:栄養と食槌.28， 453-455 
(1975) 
6 )斉藤浩，浅利喬泰:栄養と食総.29. 289-292 
(1976) 
7. 東 秀雄.山川健重.t寵瀬正明"衣~~輔. 清水泰
主幹.杉井畝三郎.飯田 i:栄養と食治.18. 134-
137(1965) 
8 )東秀縫.寺悶和子，中平智チ:ビタミン， 45. 113 
-120(1972) 
9) il!郷友吉.山内邦男.菅野長右エ門良化.42. 367 
-377(1968) 
10)小柳途男.和回せっ.古川令子:栄養と食組.19. 
429-432( 1966) 
11)山内苑，松下雪郎:良化.50. 525-529(1976) 
12)山内苑.絞下雪郎:農化， 50. 569-570(1976) 
13)厚生省公衆衛生局栄養課細.国民栄養の現状.第一
出版(1979)
14)勝井五一目1¥:ビタミン，54. 361-371(1980) 
15)阿部時一.勝井五一郎:栄養と食総， 28. 277-280 
(1975) 
(昭和56年1月10日受理)
Summary 
Conditions for the quantitative analysis of tocopherols by high-performance liquid chromatography (HPLC) with 
fluoresence detection were investigated. The separation of four forms of tocopherol was achieved quantitatively by 
HPLC， using Licrosorb SI-60 column( 5μm， 4 mm i.d. x 250mm) and n-hexane-isopropanol (100: 0.2) as the mobile 
phase 
The effect of凶ththe solvents， chloroform-methanol ( 2 1 ) andbenzene， on extraction of tocopherol from food 
stuffs was studied. In addition， the combination method， involving two tJmes extraction with chloroform-methanol ( 2 
1 ) follow巴dby three times extraction with benzene was examined. The results showed that such combination 
procedure ismost useful for determination of the contents of tocopherol in various foodstuffs 
(5 ) 
正誤表 (食物学)
行 ~~ 正
右 ，下から 1行 Ij 水瀬良友主:所 Ili制!1I;nム1;lr


Tocopherol Analysis in Foodstuffs by High-Performance Liquid Chromatography

http://dlisv03.media.osaka-cu.ac.jp/infolib/user_contents/kiyo/111H0000001-29-2.pdf

Tocopherol Analysis in Foodstuffs by High-Performance Liquid Chromatography

Abstract

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