In a series of bi-mensual samplings in 1966, the method of direct counting on membrane filters has been used to determine the quantity of bacteria present in the water of the Sluice-dock in Ostend (Belgium) as a possible important food-stock for oysters which are reared there

De Pauw, N.

Persoone, G.

Open Marine Archive

Eiçen 'o- '. ' '•• 
\Nes.s\.^.i ^ onomisch Stud ebureau 
Brugge ReJr^s / Boek 
Bull. Inst. r. Sel. nat. Belg. 
Bull. K. Belg. Inst. Nat. Wet. 44 26 Brux. 31.12.1968 
CONTRIBUTIONS 
A L 'ETUDE DES BACTERIES MARINES 
DU LITTORAL BELGE 
IV. Recherche quantitative de la richesse microbienne 
de leau du bassin de chasse d'Ostende 
par lecture directe sur membranes filtrantes 
PAR 
G. PERSOONE (Gent) et N. D E PAUW (Antwerpen) 
1 INTRODUCTION. 
Au cours des « Recherches sur l'Ostréiculture » dans le bassin de 
chasse d'Ostende (1960-1965), le problème de la nourriture des huîtres 
a maintes fois été soulevé. 
En effet, les chercheurs ont bien souvent été étonnés de voir les 
huîtres s'engraisser quand l'eau était pauvre en phyto- et nannoplancton. 
La question fut posée alors si, en l'absence d'autres micro-organismes, 
la biomasse bactérienne ne constituait pas un élément nutritif substantiel 
pour les huîtres. 
Cependant, la littérature révèle que, si l'on admet depuis longtemps 
que les invertébrés filtreurs peuvent consommer des microbes, la biomasse 
bactérienne totale dans la plupart des biotopes examinés est trop insigni-
fiante pour être prise en considération comme part importante de la 
nourriture. 
Or, nos recherches antérieures ont révélé que l'eau du port d'Ostende, 
comme celle du canal Noord-Eede, est très riche en germes (G. PER-
SOONE, 1966; G. P E R S O O N E - N . D E PAUW, 1968). Comme le bassin 
contient de l'eau de mer provenant du port (par les écluses situées dans 
l'arrière-port) et que son niveau est ajusté régulièrement avec l'eau 
saumâtre du Noord-Eede (par les 3 éclusettes au Sud du bassin), il est 
évident que ce biotope doit contenir également une quantité importante 
de microbes. 
i\(ök) 
2 ' G . P E R S O O N E ET N . D E P A U W . — CONTRIBUTIONS 44, 26 
Il n'est donc pas exclu a priori que, dans le cas particulier du bassin 
de chasse, la biomasse bactérienne soit significative en tant que potentiel 
alimentaire pour les Ostréidés. 
C'est pourquoi nous avons effectué en 1966 une série de prélèvements 
d'eau de surface afin d'en faire l'analyse bactériologique quantitative. 
Fig. 1. — Topographie du port d'Ostende. 
2. CHOIX DUNE METHODE. 
A) Au cours de nos analyses antérieures dans le port d'Ostende nous 
avions toujours employé la technique classique des cultures sur géloses. 
Cependant, comme J. BRISOU (1963) le signale, cette méthode donne 
des chiffres très inférieurs à la réalité, puisque le milieu le plus universel 
ne permet le développement que d'un faible pourcentage des germes 
réellement présents. En outre, les bactéries marines adhèrent le plus 
souvent à plusieurs à des particules, si bien qu'une colonie sur une 
gélose provient non pas d'un germe mais d'un paquet de germes. 
H. W . JANNASCH et G. E. JONES (1959) ont comparé 7 méthodes 
d'analyse quantitative de microbes marins. Ils affirment que les dénom-
brements directs après coloration des bactéries sur membranes filtrantes 
donnent des chiffres environ 150 fois supérieurs à ceux obtenus par la 
méthode des ensemencements sur agars. 
J. BRISOU, Y. DE RAUTLIN DE LA ROY, R. CURCIER et F. CAMPELLO 
(1963) estiment que les méthodes directes donnent des résultats 100 
44, 26 À L'ÉTUDE DES BACTÉRIES MARINES DU LITTORAL BELGE 3 
à 5.000 fois plus élevés que les cultures, quel que soit le milieu nutritif 
utilisé. 
Selon J. OvERBECK et H. D. BABENZIEN (1964), l'auteur russe RAZU-
MOV aurait trouvé des différences de 1/10 à 1/30.000 entre les géloses 
et les membranes filtrantes. 
La méthode directe a cependant de nombreux inconvénients : 
1 ) il y a toujours un certain nombre de germes inclus dans, ou présents 
sur, les membranes avant la filtration (A. E. KRISS, 1961); 
2) quand la quantité de particules détritiques en suspension dans l'eau 
est trop grande, elles masquent en partie les microbes sur les filtres 
et le dénombrement n'est plus possible (G. REINHEIMER, 1965); 
3) il est souvent difficile de distinguer les bactéries de certaines micro-
particules qui y ressemblent (H. W . JANNASCH et G. E. JONES, 1959); 
4) à moins d'employer des techniques de coloration vitale, on ne peut 
faire aucune différence entre les germes vivants et les morts (J. OvER-
BECK et H. D. BABENZIEN, 1964). 
Comme notre but premier était d'obtenir une idée de la masse totale 
des bactéries (vivantes et mortes), la méthode des membranes filtrantes, 
nous sembla préférable aux cultures sur géloses puisqu'elle donne des 
résultats plus proches de la réalité. 
B) Toutefois, afin d'établir le rapport entre la méthode directe et 
indirecte, nous avons, lors d'un échantillonnage « hors-série », procédé 
à un ensemencement sur un milieu nutritif solide, parallèlement au dénom-
brement sur filtres. 
3. MATERIEL ET METHODES. 
A) L e c t u r e d i r e c t e . 
La méthode adoptée est la modification préconisée par H. W . JAN-
NASCH (1958), où les bactéries sont colorées par l'érythrosine phénolée. 
Au heu de procéder à des dilutions comme le conseillent A. BELING 
(1950), N. M. ALFIMOV (1954) et H. W . JANNASCH (1958), nous avons 
préféré filtrer chaque fois des quantités croissantes d'eau. 
Après chaque prélèvement, 1, 2, 5, 10, 20, 50 et 100 ml d'eau furent 
filtrés sur des membranes filtrantes ( type Millipore HA ). Après colo-
ration, lavage et séchage, les filtres sont découpés et la partie centrale 
(2 cm-) déposée entre deux gouttes d'huile à immersion sur une lame 
porte-objet. 
Un examen rapide au microscope à un agrandissement 8 X 100 (Obj. 
à immersion) révèle immédiatement quels filtres (généralement 3 ou 4) 
sont susceptibles d'être analysés. Les autres (colonisation trop petite ou 
trop grande) sont écartés. 
Vingt champs furent comptés par membrane. 
4 G. PERSOONE ET N. DE PAUW. - - CONTRIBUTIONS 44, 26 
A chaque échantillonnage, un filtre vierge (contrôle) a été coloré 
et analysé, afin d'estimer le nombre de germes « inhérents » (indigènes) 
au filtre (*). 
La moyenne arithmétique des 20 champs (moins la moyenne des 
contrôles) est ensuite multipliée par le rapport : 
surface totale utile de la membrane 
surface du champ microscopique à l'agrandissement 8 X 100 
afin d'obtenir le nombre de micro-organismes présents sur chaque mem-
brane, donc dans le volume d'eau filtrée. 
En dénombrant pour chaque prélèvement 3 ou 4 filtres porteurs de 
quantités différentes de microbes, nous avons toujours réussi, en compa-
rant les moyennes ramenées à 1 ml d'eau, à éliminer les valeurs impro-
bables dues, soit à une répartition inégale des bactéries sur la surface, 
soit à la présence de particules, que l'on a de temps à autre comptées 
comme germes. 
B) C u l t u r e s u r g é l o s e . 
Lors de l'analyse bactériologique de l'eau du port d'Ostende, l'un 
de nous avait trouvé qu'une modification du milieu 2216 E de 
Cl. E. ZoBELL donnait le nombre le plus élevé de colonies (G. PER-
sooNE, 1966). 
Comme l'eau du bassin de chasse provient du port, nous avons réutilisé 
cette gélose nutritive dont voici la composition : peptone, 5 g; glucose, 1 g; 
extrait de levure, 0,1 g; FeP04, 0,1 g; agar-agar, 15 g; eau distillée, 
250 ml; eau de mer stabilisée, 750 ml; pH = 7,6 (ajusté au moyen de 
N a O H I N ) . 
Afin de détacher le plus possible les germes des particules détritiques, 
nous avons « homogénéisé » l'eau, un moment, au moyen d'un Ultra-
Turrax ( W . GUNKEL, 1964). Les colonies furent comptées après 12 jours 
d'incubation à 20 °C. 
4. PRELEVEMENTS. 
De mars à octobre 1966, des échantillons d'eau de surface ont été 
prélevés dans des bouteilles stériles d'un litre, 2 fois par mois, dans le 
bassin de chasse aux points E et W et dans l'avant-port d'Ostende à 
hauteur de la Crique des Pêcheurs (point A) (fig. 1). Les échantillons 
furent filtrés à Ostende même, à l'Institut d'Etudes Maritimes, au plus 
tard 1 heure après le prélèvement. 
(*) La plupart du temps, nous avons trouve une moyenne de 2 à 3 germes par 
champ. 
r 
44, 26 À L'ÉTUDE DES BACTÉRIES MARINES DU LITTORAL BELGE 5 
Le 12 octobre 1967, nous avons fait un prélèvement aux mêmes endroits. 
Une partie de l'eau fut filtrée sur les membranes, l'autre a servi à ensemen-
cer les géloses. 
5. RESULTATS. 
A) L e c t u r e d i r e c t e (fig. 2) . 
1 ) Pendant toute la durée de l'expérience, le nombre de germes était 
très élevé. Il n'y avait que deux résultats inférieurs à 200.000 
germes/ml (points E et W du bassin : 26-V-1966 et 19-VII-1966). 
Les maxima s'élevaient à plus de 2 millions/ml pour le bassin 
(18-VIII-1966) et plus de 9 millions/ml dans le port (18-VIII-1966). 
2) L'eau du port était toujours beaucoup plus riche en germes que celle 
du bassin, en moyenne 2 à 4 fois, avec des extrêmes pouvant aller 
jusqu'à 10-13 fois. Sur 17 prélèvements dans le port, il n'y avait que 
2 résultats inférieurs à 1 million de germes/ml et la médiane 
(2.700.000/ml) est supérieure au nombre maximum de microbes dans 
le bassin (2.200.000/ml). Les médianes dans ce dernier biotope sont 
respectivement 600.000/ml (point W ) et 660.000/ml (point E ) . 
jo Nombre de Bactéries / ml 
X 10^ 
- , , 1 1 , , 1 r 1 - ^ ^ ^ , , 1 1 1 1 r 
n 31 J* iB 12 26 S 23 7 19 * 18 30 15 S.7 13 27 
Fig. 2. — Résultats de l'analyse microbienne quantitative 
par lecture directe sur membranes filtrantes (période mars-octobre 1966). 
3) Les résultats obtenus pour les points W et E du bassin démontrent 
qu'il n'y a pas de gradient du nombre de germes dans l'axe : W - E 
du bassin. Les valeurs des deux points étaient en général assez pro-
ches l'une de l'autre. 
6 G. PERSOONE ET N. DE PAUW. — CONTRIBUTIONS 44, 26 
B) C o m p a r a i s o n m é t h o d e d i r e c t e - m é t h o d e i n d i r e c t e . 
TABLEAU. 
Port 
Bassin de chasse 
Rapport du nombre de germes dans les 
deux biotopes 
Géloses 
290.000 
30.700 
9,4 
Membranes 
filtrantes 
2.450.000 
295.000 
8,3 
Rapport 
entre les 
2 méthodes 
8,4 
9,6 
Les résultats de l 'échantillonnage du 12-X-1967 démontrent que les 
deux méthodes donnent à près le même rapport : 
nombre de germes dans l'eau du bassin 
^ (respectivement 9,4 et 8,3). 
nombre de germes dans l'eau du port 
La numération sur membranes filtrantes révèle une quantité de microbes 
preesque 10 fois supérieure à celle obtenue sur les agars ( 8,4 dans le port 
et 9,6 dans le bassin de chasse) . 
6. DISCUSSION. 
En ce qui concerne le port d 'Ostende, les chiffres obtenus par la 
méhode directe (600.000 à 9 mil l ions/ml) , confirment nos investigations 
antérieures. E n effet, par la méthode des ensememcements sur géloses 
nous avions toujours trouvé de 30.000 à 800.000 germes/ml (G. P E R -
SOONE-N. D E P A U W , 1968). Les membranes filtrantes semblent donc 
donner dans ce biotope, des résultats 10 à 20 fois supérieurs aux cultures 
sur agars . 
Comparée aux données de la littérature, l'eau du port et du bassin 
de chasse est extrêmement riche en bactéries. 
Pour le port, il faut chercher la cause de cette richesse microbienne 
dans le déversement des eaux d'égoût (deux fois par jour) , ce qui pro-
voque un énorme enrichissement du milieu en matières organiques, d'où 
une multiplication bactérienne intense et un déficit très prononcé en 
saturation d 'oxygène. 
44, 26 À L'ÉTUDE DES BACTÉRIES MARINES DU LITTORAL BELGE 7 
La grande quantité de germes que nous avons continuellement constatée 
dans le bassin est le résultat de plusieurs facteurs : 
1 ) Comme le biotope est peu profond, la turbulence de l'eau sous l'effet 
des vents remet régulièrement en suspension la couche supérieure des 
sédiments, riche en microbes (*). 
2) A chaque remplissage, le bassin reçoit l'eau du port, donc une grande 
quantité de matières organiques. 
3) Un certain volume d'eau saumâtre coule dans le bassin par les 
3 éclusettes le long du Noord-Eede. Comme ce canal draine une partie 
des eaux d'égoût de plusieurs agglomérations situées à l'Est d'Ostende, 
ses eaux contiennent également une grande quantité de matières orga-
niques. 
Cette richesse des 2 biotopes en éléments nutritifs semble d'ailleurs 
expliquer la différence assez petite (10 à 20 fois) entre les résultats de 
la méthode directe (membranes filtrantes) et indirecte (ensemencement 
sur gélose), comparée aux facteurs, allant jusqu'à 30.000, cités par cer-
tains auteurs (cfr introduction). En effet, les conditions écologiques 
du port et du bassin favorisent surtout la multiplication intense des 
germes hétérotrophes saprophytes et la plupart de ceux-ci semblent se 
développer assez facilement sur le milieu nutritif utilisé. 
7. CONCLUSIONS. 
Si nous admettons, comme Cl. E. ZOBELL et C. B. FELTHAM (1942) un 
volume bactérien moyen de 1 fx^, il y aurait dans le bassin de chasse une 
biomasse bactérienne de 0,2 à 2 mm'' par litre d'eau. La densité des 
germes marins étant voisine de celle de l'eau de mer (Cl. E. ZOBELL, 
1946), cela représenterait à peu près 0,2 à 2 mg de substance solide par 
litre. 
Si nous adoptons une profondeur moyenne de 1 m pour le bassin 
de chasse, il y aurait donc continuellement dans ce biotope, de 200 à 
2.000 kg de microbes. 
Compte tenu de l'apport régulier de matières organiques et de la 
multiplication très rapide des micro-organismes, les germes présents dans 
l'eau constituent donc indubitablement un potentiel alimentaire non négli-
geable pour les ostréides. 
Nous remercions les Professeurs Dr. J, HUBLE et Dr. F. EVENS ainsi 
que le Dr. E. LELOUP pour leurs conseils et critiques au cours de ces 
investigations. 
(*) Les premiers résultats d'expériences en cours ont montré que la surface de la 
vase contient de 12 millions à 15 millions de germes au cm^ (ensemencements sur 
géloses). 
8 G. PERSOONE ET N. DE PAUW. — CONTRIBUTIONS 44, 26 
RESUME. 
Dans une série d'analyses bi-mensuelles en 1966, la méthode de numé-
ration directe sur membranes filtrantes a été utilisée pour déterminer la 
teneur en bactéries de l'eau du bassin de chasse d'Ostende, en tant que 
nourriture potentielle des Ostréidés qu'on y cultive. 
SAMENVATTING. 
Met behulp van de methode der rechtstreekse tellingen op membraan-
fliters werd in een reeks monsternamen, in 1966, tweemaal per maand, 
de hoeveelheid bakteriën bepaald in het water van de Spuikom te 
Oostende, als mogelijke belangrijke voedingsbron voor de oesters die 
men er kweekt. 
SUMMARY 
In a series of bi-mensual samplings in 1966, the method of direct 
counting on membrane filters has been used to determine the quantity of 
bacteria present in the water of the Sluice-dock in Ostend (Belgium) as 
a possible important food-stock for oysters which are reared there. 
ZUSAMMENFASSUNG. 
In einer Reihe von Probe-entnahmen in 1966, zwei mal im Monat, 
ist, mit Hilfe der direkten mikroskopischen Zahlung auf Membranfiltern, 
die Quantitat Bakterien im Wasser von « Spuikom » in Oostende (Bel-
gien) bestimmt worden als mögliche wichtige Nâhrungsquelle fur die 
Àuster die dort gezüchtet werden. 
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RIJKSUNIVERSITEIT GENT 
LABORATORIUM VOOR OECOLOGIE, 
BIOGEOGRAFIE EN ALGEMENE BIOLOGIE. 
RIJKSUNIVERSITAIR CENTRUM ANTWERPEN 
LABORATORIUM VOOR OECOLOGIE. 


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A D GOEMAERE, Imprimeur du Roi, 21, rue de Ia Limite, Bruxelles 3 
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Contributions à l'étude des bactéries marines du littoral belge: IV. Recherche quantitative de la richesse microbienne de l'eau du bassin de chasse d'Ostende par lecture directe sur membranes filtrantes

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