Chromatin Immunopräzipitation in Fused Silica Kapillaren - Ein Miniaturisierungs-Ansatz zur Bestimmung von Protein-DNS Wechselwirkungen in Zellen

Abstract

Microsystem technology has been a fast evolving field over the last few years. Its ability to handle volumes in the sub-microliter range makes it very interesting for potential application in fields such as biology, medicine and pharmaceutical research. However, the use of micro-fabricated devices for the analysis of liquid biological samples still has to prove its applicability for many particular demands of basic research. This is particularly true for samples consisting of complex protein mixtures. The presented study therefore aimed at evaluating if a commonly used glass-coating technique from the field of micro-fluidic technology can be used to fabricate an analysis system for molecular biology. It was ultimately motivated by the demand to develop a technique that allows the analysis of biological samples at the single-cell level. Gene expression at the transcription level is initiated and regulated by DNA-binding proteins. To fully understand these regulatory processes, it is necessary to monitor the interaction of specific transcription factors with other elements - proteins as well as DNA sites - in living cells. One well-established method to perform such analysis is the Chromatin Immunoprecipitation (CHIP) assay. To map protein-DNA interactions, living cells are treated with formaldehyde in vivo to cross-link DNA-binding proteins to their resident sites. The chromatin is then broken into small fragments, and specific antibodies against the protein of interest are used to immunopurify the chromatin fragments to which those factors are bound. After purification, the associated DNA can be detected and analyzed using Polymerase Chain Reaction (PCR). Current CHIP technology is limited as it needs a relatively large number of cells while there is increasing interest in monitoring DNA-protein interactions in very few, if not single cells. Most notably this is the case in research on early organism development (embryogenesis). To investigate if microsystem technology can be used to analyze DNA-protein complexes from samples containing chromatin from only few cells, a new setup for fluid transport in glass capillaries of 75 µm inner diameter has been developed, forming an array of micro-columns for parallel affinity chromatography. The inner capillary walls were antibody-coated using a silane-based protocol. The remaining surface was made chemically inert by saturating free binding sites with suitable biomolecules. Variations of this protocol have been tested. Furthermore, the sensitivity of the PCR method to detect immunoprecipitated protein-DNA complexes was improved, resulting in the reliable detection of about 100 DNA fragments from chromatin. The aim of the study was to successively decrease the amount of analyzed chromatin in order to investigate the lower limits of this technology in regard to sensitivity and specificity of detection. The Drosophila GAGA transcription factor was used as an established model system. The protein has already been analyzed in several large-scale CHIP experiments and antibodies of excellent specificity are available. The results of the study revealed that this approach is not easily applicable to "real-world" biological samples in regard to volume reduction and specificity. Particularly, material that non-specifically adsorbed to capillary surfaces outweighed the specific antibody-antigen interaction, the system was designed for. It became clear that complex biological structures, such as chromatin-protein compositions, are not as easily accessible by techniques based on chemically modified glass surfaces as pre-purified samples. In the case of the investigated system, it became evident that there is a need for more research that goes beyond the scope of this work. It is necessary to develop novel coatings and materials to prevent non-specific adsorption. In addition to improving existing techniques, fundamentally new concepts, such as microstructures in biocompatible polymers or liquid transport on hydrophobic stripes on planar substrates to minimize surface contact, may also help to advance the miniaturization of biological experiments.Die Mikrosystemtechnologie hat sich in den letzten Jahren mit unvorhergesehener Dynamik entwickelt. Vor allem die Möglichkeit, in Mikrostrukturen und Kanälen Flüssigkeitsvolumen von weniger als einem Mikroliter zu manipulieren und zu transportieren begründet ihr großes Potential für Anwendungen in Bereichen wie der Biologie, der Medizin und der pharmazeutischen Forschung. Der Einsatz der Mikrofluidik bei der Analyse biologisch relevanter Proben, zum Beispiel von komplexen Mischungen mehrerer Proteine, ist jedoch noch sehr begrenzt. Der wesentliche limitierende Faktor sind Wechselwirkungen der Proteine mit den Wänden der Mikrokanäle. Vor diesem Hintergrund untersucht die vorliegende Arbeit die Anwendung einer in der Mikrofluidik verbreiteten Methode zur Beschichtung von Glasoberflächen auf ein Analyseverfahren der Molekularbiologie. Auf der Ebene der Transkription wird die Regulierung der Genexpression vor allem von DNA-bindenden Proteinen kontrolliert. Um diesen Vorgang ganz zu verstehen ist es notwendig, die Wechselwirkung spezifischer Transkriptionsfaktoren mit bestimmten Elementen - Proteinen wie auch DNA-Sequenzen - in lebenden Zellen zu untersuchen. Eine etablierte Methode zur Erforschung solcher Fragestellungen ist der Chromatin Immunoprecipitation (CHIP) assay. Um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu bestimmen werden lebende Zellen mit Formaldehyd behandelt um die Proteine an ihre Bindungsstellen in vivo zu fixieren. Anschließend wird das Chromatin in kleine Fragmente geschnitten und mit spezifischen Antikörpern, an die der spezifische Faktor gebunden ist, aufgereinigt. Die assoziierte DNA kann mit der Polymerase Chain Reaction (PCR) analysiert werden. CHIP-Analysen benötigen relativ viele Zellen. Es besteht aber ein großes Interesse, Protein-DNA-Wechselwirkungen in wenigen oder sogar einzelnen Zellen zu untersuchen. Dies betrifft vor allem die Forschung an frühen Entwicklungsstadien von Organismen (Embryogenese). Mit dem Ziel, Protein-DNA-Komplexe von wenigen Zellen zu analysieren wurde ein Array von Mikrosäulen für Affinitätschromatographie entwickelt. Der Kern dieses neuen Aufbaus für den Transport von Flüssigkeiten besteht aus 8 parallelen Glaskapillaren mit einem Innendurchmesser von 75 µm. Die inneren Wände der Kanäle sind mit Antikörpern beschichtet. Das auf Silanisierung basierende Protokoll bindet jedes beliebige Protein kovalent an die Glasoberfläche und erlaubt gleichzeitig, die Beschichtung gegen unspezifische Adsorption abzuschirmen. Mehrere Parameter dieser Beschichtung wurden variiert. Weiterhin wurde die Empfindlichkeit der PCR-Detektion der immunoprezipitierten Protein-DNA Komplexe verbessert, wodurch ein zuverlässiger Nachweis von etwa 100 DNA Fragmenten aus Chromatin möglich ist. Das Ziel der Arbeit ist, die Menge an eingesetztem Chromatin schrittweise zu verringern um die Grenzen in Bezug auf Nachweisgrenze und Spezifizität zu charakterisieren. Als molekulares Modellsystem für diesen Miniaturisierungsansatz wurde der GAGA Transkriptionsfaktor in Drosophila gewählt, da dieses Protein schon in vielen CHIP-Experimenten untersucht wurde und Antikörper mit sehr guter Affinität zur Verfügung stehen. Die experimentellen Ergebnisse dieser Studie zeigen die Grenzen des beschriebenen Ansatzes bezüglich Volumenreduzierung und Spezifizität auf. Die Effekte von unspezifisch an den Oberflächen adsorbierendem Probenmaterial überdecken die spezifische Wechselwirkung mit der Antikörperbeschichtung. Im Gegensatz zu vorher aufgereinigten Proben sind komplexe biologische Strukturen wie Chromatin offensichtlich schwer zugänglich für Analysetechniken, die auf chemisch modifizierten Glasoberflächen basieren. Es ist deutlich geworden, dass im Falle biologischer Systeme wie dem hier beschriebenen ein Bedarf für weitere Forschungssarbeit besteht, der über den Rahmen dieser Arbeit hinausgeht. Es werden vor allem neue Materialien und Beschichtungen mit wesentlich besseren Eigenschaften gegen unspezifische Adsorption benötigt. Auch grundsätzlich neue Ansätze und Konzepte - wie Mikrostrukturen aus biokompatiblen Polymermaterialien oder Flüssigkeitstransport auf hydrophoben Streifen auf planaren Substraten zur Minimierung des Proben-Oberflächen-Kontakts - können helfen, miniaturisierte Experimente mit biologischen Proben voranzubringen