More than 360 million people worldwide are persistently infected with the hepatitis B virus (HBV). The recommended treatment of chronic hepatitis B with interferon-α and/or nucleoside analogues does not lead to satisfactory results. It is well documented that the viral persistence is caused by an absence of the effective virus-specific T cell response. Therefore, the induction of HBV-specific T cells by therapeutic vaccination may be an innovative strategy to overcome virus persistence. Vaccination with commercially available HBV vaccines and DNA vaccines in patients did not result in an induction of the immune response, which would effectively control the HBV infection. Due to this, a more potent therapeutic vaccines are needed. The woodchuck (Marmota monax) is a useful preclinical model for developing new therapeutic approaches in chronic hepadnaviral infections. Several approaches using classical protein and DNA vaccines were tested previously in the woodchuck model without success. The high viral load observed in chronic hepadnaviral infections may have impaired the induction of an effective virus-specific T cell response. Therefore, the application of more potent vaccines, e.g. recombinant viral vectors in combination with antiviral treatment, may be required to achieve sustained antiviral response.
In the presented study, an innovative therapeutic strategy, combining vaccination with optimized DNA and recombinant adenoviral vectors (AdV), as well as potent antiviral treatment with entecavir (ETV), was evaluated in the woodchuck model. It was hypothesized that this approach may be an effective strategy to improve WHV-specific immune responses and as a result lead to the resolution of chronic WHV infection.
For that purpose, an improved DNA vaccine (pCGWHc), adenoviral vector serotype 5 (Ad5WHc) and chimeric Ad5 displaying Ad35 fiber (Ad35WHc) expressing high levels of woodchuck hepatitis core antigen (WHcAg) were constructed. The efficacy of the improved vaccines was tested first in mice and in naïve woodchucks. The improved WHcAg expression by pCGWHc caused a detection of significantly stronger CD8+ T cell response (interferon-γ production) and higher anti-WHc levels in C57BL/6 mice, compared to the previously used DNA plasmid vaccine. Immunization of mice by pCGWHc prime-AdV boost regimen enhanced CD8+ T cell response even more, compared to immunization with DNA alone. Moreover, the vigorous cytotoxic activity of these WHcAg-specific CD8+ T cells could be demonstrated in vivo. To further evaluate the efficacy of the new prime-boost regimen the vaccination of WHV transgenic mice (1217 WHV Tg) was performed. The immunizations elicited an unexpected anti-WHc and anti-WHs antibodies and WHcAg-specific CD8+ T cell response which led to a significant suppression of WHV replication in those mice. Next, the heterologous Ad5WHc/Ad35WHc immunization was performed in naïve woodchucks. The immunization resulted in the induction of a strong cellular immune response in woodchucks and protected them from WHV infection after the challenge. Altogether, these results clearly showed, that heterologous DNA-AdV immunization induces a more potent WHV-specific immune response than previously investigated strategies in mice and woodchucks. Therefore, this novel DNA prime-AdV boost regimen was used to treat chronically WHV-infected woodchucks in combination with entecavir (ETV) to induce a proper CTL response. Seven animals were treated with ETV for 23 weeks. Starting from week 8, five of them received additional 9 immunizations with DNA plasmids, expressing WHcAg and WHsAg, Ad5WHc and Ad35WHc. For the first time, the significant WHsAg- and WHcAg-specific proliferative responses (CD4) and degranulation responses (CD8) were detected in all chronic carriers that received immunizations in combination with ETV treatment. Moreover, 2 of 4 immunized woodchucks, which completed the ETV and vaccination treatment, demonstrated sustained antiviral response (undetectable viral load and development of anti-WHs).
These findings indicate that the therapeutic approach evaluated in this study induces a potent T cell response and seems to be an effective strategy to achieve sustained control of chronic hepadnaviral infections. These results obtained in a preclinical model might be the base for the clinical trials of therapeutic vaccines which induce strong anti-core T cell response in combination with antivirals as a possible immunotherapy in chronically HBV-infected patients.Weltweit sind derzeit mehr als 360 Millionen Menschen mit dem Hepatitis B Virus (HBV) chronisch infiziert. Die empfohlenen Behandlungsstategien bei chronischer Hepatitis B, bestehend aus Interferon-α und/oder Nukleosid-Analoga, zeigen keine zufriedenstellenden Erfolge. In der Literatur ist beschrieben, dass die Viruspersistenz durch das Fehlen einer effektiven virusspezifischen T-Zellantwort mitunter verursacht wird. Daher stellt die Induktion einer HBV-spezifischen T-Zellantwort durch eine therapeutische Vakzinierung eine innovative Strategie zur Behandlung dar, um die Viruspersistenz zu überwinden. Die Schutzimpfung mit kommerziell erhältlichen HBV-Impfstoffen und DNA-Vakzinen in Patienten führt zu keiner ausreichenden Immunantwort, die HBV effektiv kontrolliert. Infolgedessen werden neue wirksame therapeutische Impfstoffe dringend benötigt. Das nordamerikanische Waldmurmeltier (Marmota monax; engl. woodchuck) ist ein nützliches, präklinisches Modell zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze in chronischen hepadnaviralen Infektionen. Bisherige Therapieansätze im Murmeltier Model, unter Verwendung von klassischen Protein- und DNA-Vakzinen waren ohne Erfolg. Die hohe Viruslast, die in chronischen hepadnaviralen Infektionen beobachtet wird, kann die effektive, virusspezifische T-Zellantwort beeinträchtigen. Aus diesem Grund werden wirksamere Impfstoffe, wie zum Beispiel eine Kombination aus rekombinanten viralen Vektoren und antivirale Behandlung benötigt, um eine andauernde antivirale Antwort zu erzielen.
In der vorliegenden Arbeit wurde eine innovative therapeutische Strategie im Murmeltier-Model verfolgt, die in einer kombinierten Vakzinierungsstrategie aus optimierten DNA- und rekombinanten Adenoviralen Vektoren (AdV) sowie aus einer wirksamen, antiviralen Behandlung mit Entecavir (ETV) bestand. Es wurde angenommen, dass dieser Ansatz eine effektive Immunisierungsstrategie darstellt, um eine spezifische Immunantwort gegen das Murmeltier Hepatitis Virus (WHV) zu verbessern und als Ergebnis zu einer Eliminierung der chronischen WHV-Infektion führt.
Zu diesem Zweck wurden Vektoren konstruiert, die das Murmeltier Hepatitis Core Antigen (WHcAg) stark exprimieren: ein verbesserter DNA-Impfstoff (pCGWHc), ein Adenoviraler Vektor des Serotyps 5 (Ad5WHc) und einen chimären Ad5 mit präsentierenden Ad35 Fibern. Die Wirksamkeit dieser verbesserten Impfstoffe wurde zuerst in Mäusen und in naiven Murmeltieren getestet. Die durch pCGWHc verbesserte WHcAg Expression bewirkte eine signifikant stärkere CD8+ T-Zellantwort (Interferon γ Produktion) und höhere anti-WHc Level in C57BL/6 Mäusen als in zuvor verwendeten DNA Plasmid-Vakzinen. Im Vergleich zu DNA-Immunisierung konnte eine weitere Verbesserung der CD8+ T-Zellantwort erzielt werden, indem eine pCGWHc „prime-AdV boost“ Immunisierungsstrategie in Mäusen angewandt wurde. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass diese WHcAg-spezifischen CD8+ T-Zellen eine starke zytotoxische Aktivität in vivo besaßen. Zur weiteren Beurteilung der neuen „prime-boost“ Strategie wurden WHV-transgene Mäuse (1217 WHV Tg) immunisiert. Die Immunisierung rief eine unerwartete anti-WHc und anti-WHs Antikörperproduktion sowei eine WHcAg-spezifische CD8+ T-Zellantwort aus, die zu einer signifikanten Verminderung der WHV Replikation in den Mäusen führte. Im Anschluss wurde die heterologe Ad5/Ad35WHc Immunisierung in naiven Murmeltieren durchgeführt, welche eine starke zelluläre Immunantwort ausgelöste. Des Weiteren bot diese Immunisierungsstrategie effektiven Schutz vor einer WHV-Infektion. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass eine heterologe DNA-AdV Immunisierung eine weitaus stärkere WHV-spezifische Immunantwort induzieren kann, als die zuvor in Mäusen und Murmeltieren angewandten Immunisierungsstrategien. Zu diesem Zweck wurde diese neuartige DNA „prime-AdV boost“ Strategie dazu verwendet, chronisch WHV-infizierte Murmeltiere in Kombination mit ETV für 23 Wochen zu behandeln. Ausgehend von Woche 8 erhielten 5 der chronisch WHV-infizierten Murmeltiere 9 Immunisierungen mit den DNA-Plasmiden, welche WHcAg und WHsAg sowie Ad5WHc und Ad35WHc exprimieren. Zum ersten Mal konnte eine signifikante WHsAg- und WHcAg-spezifische Proliferationsantwort (CD4) und Degranulationsantwort (CD8) in allen chronisch infizierten Murmeltieren detektiert werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass 2 aus 4 immunisierten Murmeltieren, die die Behandlung mit ETV und Vakzine abgeschlossen hatten, eine anhaltende antivirale Immunantwort aufwiesen.
Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass der gewählte therapeutische Ansatz eine wirksame T-Zellantwort induziert und eine effektive Behandlungsstrategie zu sein scheint, um eine anhaltende Kontrolle von chronischen hepadnaviralen Infektionen zu erzielen. Die in dieser Arbeit beschriebenen Befunde im prä-klinischen Model könnten die Basis für eine klinische Studie zur therapeutischen Vakzinierung zur Immuntherapie chronischer HBV-infizierter Patienten darstellen, die in Kombination mit antiviralen Agentien in der Lage ist eine starke anti-Core T-Zellantwort zu erzielen
