The renin-angiotensin system is a key regulator of blood pressure and electrolyte homeostasis. Most hemodynamic responses to angiotensin II are mediated via angiotensin II type 1 receptor (AT1R). The 3 -untranslated region (3 UTR) of AT1R mRNA is important in posttranscriptional regulation of AT1R expression. It contains multiple adenylate-uridylate-rich elements that are recognized by various RNA-binding proteins (RNBP) affecting the stability, conformation, subcellular localization, and translation of their target mRNAs.
The aim of this study was to identify novel AT1R 3 UTR-binding RNBPs and understand their physiological role in AT1R function. AT1R 3 UTR-associated RNBPs were isolated from human vascular smooth muscle cells by protein affinity purification using AT1R 3 UTR as a probe. Mass spectrometric identification of the isolated proteins led to identification of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), Hu antigen R (HuR) and TIA1 cytotoxic granule-associated RNA-binding protein (TIA-1).
GAPDH was identified as a novel AT1R mRNA-binding protein that suppresses AT1R translation. GAPDH binds to a hairpin-structure rich in adenosine and uridine in the proximal region of AT1R 3 UTR. Hydrogen peroxide-induced oxidative stress increased AT1R expression by dissociating GAPDH from AT1R 3 UTR and relieving it from the GAPDH-mediated suppression.
Insulin-induced increase in AT1R expression was shown to be posttranscriptionally mediated by HuR. Insulin stabilized AT1R mRNA in a 3 UTR-dependent manner and HuR was shown to bind AT1R 3 UTR. Insulin induced nucleocytoplasmic translocation of HuR to cytoplasm and increased HuR binding to AT1R 3 UTR. This increased AT1R expression via stabilization of AT1R mRNA.
AT1R avoids the endoplasmic reticulum (ER) stress-mediated translational suppression. Binding of TIA-1 to AT1R 3 UTR was shown to suppress AT1R expression. TIA-1 normally colocalized with AT1R mRNA in the cytoplasm. However, during ER stress TIA-1 was dissociated and directed to translationally silenced stress granules, while AT1R mRNA remained excluded from them. Thus, AT1R mRNA avoids aggregation to SGs and TIA-1-mediated translational suppression during ER stress.
In conclusion, oxidative stress, insulin, and ER stress regulates AT1R expression posttranscriptionally by affecting the binding of GAPDH, HuR, and TIA-1 to its mRNA 3 UTR.Reniini-angiotensiinijärjestelmä on keskeinen verenpaineen ja kehon elektrolyytitasapainon säätelijä. Angiotensiini II:n vaikutukset välittyvät pääasiassa tyypin 1 angiotensiini II -reseptorin (AT1R) kautta. AT1R:n lähetti-RNA:n (mRNA) 3 -pään transloitumaton alue (3 UTR) on keskeinen AT1R:n transkription jälkeisessä säätelyssä. Se sisältää useita adenylaatti-uridylaattipitoisia alueita, jotka ovat RNA:ta sitovien proteiinien kohteita. Ne vaikuttavat kohde-mRNA-molekyyliensä puoliintumisaikaan, konformaatioon, solunsisäiseen sijaintiin ja translaatioon.
Tutkimuksen tavoitteena oli tunnistaa uusia AT1R:n 3 UTR:ään sitoutuvia proteiineja ja ymmärtää niiden fysiologiset vaikutukset AT1R:n toiminnassa. Käyttäen AT1R:n 3 UTR:ää koettimena siihen sitoutuvat proteiinit eristettiin ihmisen verisuonten sileälihassoluista. Sitoutuneista proteiineista tunnistettiin massaspektrometrialla glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), HuR (Hu antigen R) ja TIA-1 (TIA1 cytotoxic granule-associated RNA binding protein).
GAPDH havaittiin AT1R:n mRNA:ta sitovaksi proteiiniksi, joka estää sen translaatiota. GAPDH sitoutuu AT1R:n 3 UTR:n alussa sijaitsevaan adenosiiniä ja uridiinia sisältävään hiuspinnirakenteeseen. Vetyperoksidin aiheuttama hapetusstressi lisäsi AT1R:n ilmentymistä irrottamalla GAPDH:n 3 UTR:stä estäen näin GAPDH:n negatiivisen vaikutuksen.
Insuliinin lisäämä AT1R:n ilmentyminen osoitettiin johtuvan HuR:n välittämästä transkription jälkeisestä säätelystä. Insuliini vakautti AT1R:n mRNA:ta 3 UTR:n kautta ja HuR:n osoitettiin sitoutuvan tälle alueelle. Insuliini lisäsi HuR:n siirtymistä tumasta solulimaan ja sitoutumista AT1R:n 3 UTR:ään. Tämä lisäsi AT1R:n ilmentymistä vakauttamalla sen mRNA:ta.
AT1R välttää endoplasmakalvoston (ER) stressin aiheuttaman translaation eston. TIA-1 vähensi AT1R:n ilmentymistä 3 UTR:n välityksellä. Tavallisesti TIA-1 ja AT1R:n mRNA kolokalisoituvat solulimassa, mutta ER-stressin aikana TIA-1 siirtyy translationaalisesti hiljennettyihin stressigranuloihin AT1R:n mRNA:n jäädessä niiden ulkopuolelle. Näin ollen AT1R:n mRNA välttää kertymisen stressigranuloihin ja TIA-1:n välittämän translationaalisen hiljentämisen ER-stressin aikana.
Yhteenvetona: hapetusstressi, insuliini ja ER-stressi säätelevät AT1R:n ilmentymistä transkription jälkeisellä tasolla vaikuttamalla GAPDH:n, HuR:n ja TIA-1:n sitoutumiseen sen mRNA:n 3 UTR-alueelle
