Outbreaks of bacteria causing hospital and community acquired infections have dramatically increased in number over the recent years. For example, travelers become colonized by resistant bacteria and may transmit the strains to other people and to medical care settings when they return home. The challenge is new and problematic for laboratories performing bacterial diagnostics. Fast and highly specific tools are needed to identify and characterize resistant bacterial strains in order to prevent outbreaks in local hospitals.
This thesis studies the fast identification of virulence and resistance genes of the most important hospital acquired (HA) bacteria. In addition, the applicability of rapid outbreak analysis for HA-bacteria using molecular methods outside of the national reference laboratory was studied. The aim of the study was to establish a sensitive, reliable multiplex-PCR method suitable for daily use in a microbiological diagnostic laboratory and to speed up the reporting of bacteria causing outbreaks. Another aim was to study the usefulness and functionality of a commercial repetitive PCR (DiversiLab) and compare it with reference molecular typing methods. The thesis also gives an overall view of the occurrence of HA-bacteria witnessed in the district of Helsinki and Uusimaa over the recent years.
The thesis consists of six studies on four different bacterial species/types causing outbreaks: MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus), ESBL (Extended Spectrum Beta-Lactamase)-producing Enterobacteriaceae, Acinetobacter baumannii and Clostridium difficile. Consecutive and retrospective bacterial isolates of the each bacteria were collected and examined. The methods used were conventional multiplex PCR and real-time multiplex PCR. The typing methods were repetitive PCR (DiversiLab), PFGE (pulsed field gel electrophoresis), PCR ribotyping, spa typing, and sequencing-based methods.
During this thesis three usable in-house multiplex PCRs were established for the detection of MRSA, carbapenemase genes, and virulence genes in C. difficile. The repetitive PCR method, DiversiLab, was found to be a fast and proprietary typing method, very beneficial in the first-line identification of outbreaks. In addition, the Diversilab system may be used in the comparison of resistant bacterial isolates. The method produced better results with Gram-negatives (ESBL-producing Enterobacteriaceae and A. baumannii). However, the reference methods still serve their purpose in global isolate comparison. In the future, whole genome sequencing will, however, most likely replace contemporary typing methods.Sairaalainfektioita aiheuttavat sairaalabakteerit ovat lisääntyneet viime aikoina. Matkailijat tuovat mukanaan entistä resistentimpiä bakteerikantoja omiin sairaaloihimme sairaalasiirtojen yhteydessä. Tämä haaste on uusi ja ongelmallinen myös bakteereita tunnistaville laboratoriolle. Tarvitaan tarpeeksi spesifisiä ja nopeita työkaluja tunnistamaan ja kartoittamaan nämä mikrobilääkkeille resistentit bakteerikannat, jotta estetään näiden kantojen leviäminen omissa sairaaloissamme mahdollisimman tehokkaasti.
Tämä väitöskirjatutkimus käsittelee tärkeimpien sairaalabakteerien entistä nopeampaa virulenssi- ja resistenssigeenien tunnistamista, sekä bakteerikantojen molekyylibiologista tyypittämistä keskussairaalatasolla. Tutkimuksen tarkoituksena oli pystyttää rutiinikäyttöön sairaalabakteerien tutkimiseen tarkoitettuja nopeampia virulenssi- ja resistenssigeenejä tunnistavia ns. multiplex-PCR-menetelmiä. Lisäksi tarkoituksena oli tutkia uusien ja nopeampien tyypittämismenetelmien toimivuutta ja käytettävyyttä vanhoihin standardimenetelmiin verrattuna. Samalla tutkimus antaa kuvan viime vuosien tilanteesta Helsingin ja Uudenmaan sairaanhoitopiirin alueella esiintyvistä sairaalabakteerikannoista.
Tutkimus koostuu kuudesta osajulkaisusta, joissa käsitellään neljän eri bakteerilajin tai -tyypin aineistoja. Bakteerit ovat MRSA (metisilliinille resistentti Staphylococcus aureus), enterobakteerien kannat, jotka muodostavat ESBL-entsyymejä (Extended Spectrum Beta-Lactamase), Acinetobacter baumannii ja Clostridium difficile. Kustakin lajista ja tyypistä oli kerätty peräkkäisiä (konsekutiivisiä) sekä takautuvia sairaalabakteerikantoja. Tutkimuksessa käytettiin erilaisia PCR-menetelmiä, kuten konventionaalinen ja reaaliaikainen multiplex-PCR. Tyypitysmenetelminä käytettiin kaupallista DiversiLab-menetelmää (repetitiivinen PCR), PFGE (pulssikenttäelektroforeesi)-menetelmää, PCR-ribotyypitystä, spa-tyypitystä ja erilaisia sekvensointiin perustuvia tyypitysmenetelmiä.
Väitöskirjatyön aikana pystytettiin kolme erilaista multiplex-PCR menetelmää, joiden avulla edelleen tunnistetaan MRSA, karbapenemaasien tuottogeenejä sekä C. difficilen virulenssigeenejä. Repetetiivisellä PCR menetelmällä tehdyissä tutkimuksissa havaintomme oli, että kaupallinen nopeampi bakteerien tyypitysmenetelmä, DiversiLab, voisi olla hyödyksi kantojen vertailussa. Näin voitaisiin saada lisäarvoa epidemioiden ja niitä aiheuttavien bakteerikloonien nopeaan ensilinjan tunnistamiseen, varsinkin gramnegatiivisten bakteerien, kuten ESBL:n ja A. baumanniin kohdalla. Perinteisemmillä menetelmillä, kuten PFGE, on vielä toistaiseksi paikkansa kansainvälisessä kantavertailussa. Tulevaisuudessa kantojen kokogenomisekvensointi tullee kuitenkin syrjäyttämään tämänhetkisiä tyypitysmenetelmiä
