The flat bones of the skull, the calvarial bones, develop by intramembranous ossification during which mesenchymal cells first condense and subsequently differentiate into osteoblasts. Sutures separate the calvarial bones and facilitate the synchronized growth of the underlying brain and the calvaria.
Hedgehog (Hh) signalling has an indisputable role in craniofacial development as well as during endochondral ossification. Yet, little is known about its function during intramembranous ossification of the calvarial bones. GLI-Kruppel family member 3 (Gli3) is a zinc-finger transcription factor that mediates Hh signalling. In the absence of Hh ligand Gli3 is proteolytically cleaved into a repressor that inhibits transcription of Hh target genes. Mutations in GLI3 cause Greig cephalopolysyndactyly syndrome in humans, in which an infrequent, but significant feature is premature fusion of the metopic suture (interfrontal suture in mice). We have used Gli3 loss-of- function mouse (Gli3Xt-J/Xt-J) as a model to investigate the effects of aberrant Hh signalling during calvarial development.
In my thesis I describe how loss of Gli3 causes craniosynostosis of the lambdoid as well as interfrontal sutures in mice. Elevated proliferation and ectopic differentiation of osteoprogenitors underlies this phenomenon. We were able to rescue craniosynostosis in these mice by two mechanisms. Firstly, by elevating fibroblast growth factor (Fgf) signalling in the suture prior to its fusion by imbedding Fgf2 soaked beads in tissue culture. This induced Twist1 expression, which inhibits function of ectopically expressed Runx2. Secondly, craniosynostosis was prevented by genetically reducing Runx2 activity by generating Gli3Xt-J/Xt-J;Runx2+/- mice, which normalized elevated levels of Bmp signalling in the affected sutures. We also put forward a model of how Hh signalling helps to maintain the integrity of bone margins during calvarial development. The repressor isoform of Gli3 inhibits Runx2 activity in the early osteoprogenitor cells. Runx2, on the other hand, activates Ihh expression in the mature osteoblasts, which then induces osteogenesis by inhibiting the function of Gli3 repressor.
Our findings indicate that Gli3 and Hh signalling have an important role in mediating the location of osteoblast differentiation and the speed of bone formation in the developing calvaria. Uncovering the cellular and molecular mechanisms that underlie normal calvarial development, as well as pathological processes, is a vital step in developing treatment strategies for patients with craniosynostosis.Kallon litteät peitinluut kehittyvät ns. suoran luutumisen mekanismilla eli intramembranoottisesti: mesenkymaaliset solut muodostavat ensin tiivistymän, jonka jälkeen ne erilaistuvat asteittain luusoluiksi eli osteoblasteiksi. Kasvavia kallon peitinluita erottavat kallon saumat, joissa luiden aktiivinen kasvu jatkuu mahdollistaen alla olevien aivojen samanaikaisen kasvun. Kraniosynostoosi on patologinen tila, jossa yksi tai useampi kallon sauma luutuu ennenaikaisesti. Tällöin kasvu kyseisessä kallon saumassa loppuu, mikä johtaa kallon, silmäkuoppien ja kasvojen epäsymmetriseen kasvuun, sekä neurologisiin oireisiin. Toistaiseksi ainoa hoitokeino on luutuneen sauman kirurginen avaus.
Hedgehog (Hh) viestintäreitillä on merkittävä rooli sekä kraniofakiaalisen kehityksen että endokondraalisen luutumisen aikana. Kuitenkin, sen mahdollisesta tehtävästä intramembranoottisten kallon peitinluiden kehityksessä tiedetään varsin vähän. Gli3 on transkriptiotekijä, joka säätelee Hh signalointia. Hh-viestimolekyylin puuttuessa Gli3 pilkotaan proteolyyttisesti lyhyempään repressori-muotoon, mikä estää Hh viestintäreitin kohdegeenien ilmentymistä. Ihmisellä mutaatiot GLI3 geenissä aiheuttavat Greig kefalopolysyndaktylia-oireyhtymän, jonka harvinainen, mutta merkittävä piirre on metooppisen sauman (interfrontaalisauma hiirellä) kraniosynostoosi.
Tässä väitöskirjatyössä käytimme mallina Gli3-poistogeenistä hiirtä (Gli3Xt-J/Xt-J) tutkiessamme epänormaalin Hh signaloinnin vaikutusta kallon peitinluiden kehitykseen. Hiirellä Gli3 geenin puutos johti sekä lambda- että interfrontaalisaumojen kraniosynostoosiin. Kraniosynostoosin taustalta paljastui kiihtynyt solujen jakautuminen sekä ektooppinen osteoblastien erilaistuminen. Pystyimme estämään saumojen ennenaikaisen luutumisen Gli3-poistogeenisessä hiiressä kahdella mekanismilla. 1) Lisäsimme fibroblastikasvutekijäperheeseen kuuluvaa Fgf2-proteiinia kudosviljelmässä paikallisesti lambdasaumaan ennen sen luutumista. Fgf2 indusoi saumassa Twist1-geenin ilmentymisen, mikä puolestaan esti ektooppisesti ilmentyvän Runx2:den toiminnan. Runx2 on välttämätön osteoblastien erilaistumiselle. 2) Vähensimme myös Runx2-geenin aktiivisuutta poistamalla Gli3-poistogeenisestä hiirestä yhden kopion Runx2-geeniä (Gli3Xt-J/Xt-J;Runx2+/-), mikä normalisoi lisääntyneen luun morfogeeninen kasvutekijä (Bmp)-viestintäreitin aktiivisuuden affektoituneissa saumoissa.
Väitöskirjassani kuvaamme mallin, jossa Hh viestintäreitti säätelee kallon peitinluiden muodostusta kallon saumassa. Gli3:n repressori-muoto ilmentyy hyvin varhaisissa osteoblastien esiasteissa, luun sauman puoleisella reunalla, jossa se rajoittaa näiden solujen erilaistumista estämällä Runx2:den toimintaa. Toisaalta, myöhemmässä osteoblastien erilaistumisvaiheessa Runx2 aktivoi Hh-viestimolekyylin, Indian hedgehogin, ilmentymisen, mikä puolestaan edistää osteoblastien erilaistumista estämällä Gli3-repressorin muodostusta.
Tämän väitöskirjan tulokset osoittavat, että Gli3:lla ja Hh viestintäreitillä on merkittävä rooli kallon kehityksen aikana, sekä osteoblastien erilaistumispaikan että erilaistumisnopeuden säätelyssä. Normaalin kallon kehityksen ja patologisten tilanteiden taustalla olevien solu- ja molekyylitason mekanismien selvittäminen on välttämätön askel uusien hoitomuotojen kehityksessä kraniosynostoosipotilaille
