Inteins are selfish but harmless autocatalytic proteins that perform a post-translational modification, termed protein splicing. In protein splicing an intein excises itself off from the precursor protein and simultaneously ligates the flanking proteins together with a peptide bond. Inteins are found sporadically distributed in unicellular organisms, but their biological functions remain obscure. Importanly, inteins that are split into two can remain active and perform protein ligation by protein trans-splicing (PTS). In principle, PTS allows ligation of any two protein-sequences, with the only requirement being Ser, Thr, or Cys as the first residue downstream of the intein. This has inspired development of numerous biotechnological applications including protein semisynthesis, segmental isotopic labeling, and cyclization. Protein ligation by split inteins is, however, limited by the lengths, substrate specificity, orthogonality, and the reaction yields of the split inteins.
The objective of this thesis was to advance the development of protein splicing as a protein-ligation tool. First, the split site of a natively split DnaE intein was shifted in order to engineer a split intein with shorter C-intein that could be easily chemically synthetized. The newly engineered split intein could perform protein ligation in high yields and was demonstrated to be in certain cases even better than the natively split intein. Encouraged by this, 21 more split inteins were engineered starting from four different inteins, guided by the three dimensional structures of these inteins. Split inteins were systematically tested for activity and orthogonality to evaluate their potential for biotechnological applications.
Next, the scope was widened to bacterial intein-like (BIL) domains. BIL domains belong to the same superfamily with inteins but are distinct by their distribution and functions and have a wider variety of residues at the downstream junction. The first structure of a BIL domain was solved. It highlighted their homology to inteins as well as allowed engineering of split BIL domains. The split BIL domains could perform protein ligation also with Ala at the downstream splicing junction, although in minute yields, which could be the first step towards nucleophile-free protein ligation.
Finally, discovery of a previously not reported intermolecular protein-splicing reaction, termed intein-mediated protein alternative splicing (iPAS), was described. Structural studies revealed that three-dimensional domain swapping is the underlying mechanisms of iPAS. iPAS makes it possible to increase diversity at protein level, without altering the genetic code, and could be used to control protein functions in concentration and expression-order dependent manner. Discovery of this new phenomenon could allow protein interference and is opening new insights into the possible biological functions of inteins.Proteiinien silmukointi työkaluna proteiinien muokkauksessa ja aktiivisuuden säätelyssä
Tässä työssä on tutkittu proteiinien silmukointia sekä mahdollisuuksia hyödyntää sitä bioteknologian sovelluksissa. Työssä kehitettiin olemassa olevia proteiinien silmukointiin perustuvia ligaatio-menetelmiä sekä kuvataan uudenlainen intermolekulaarinen proteiinien silmukointi -mekanismi, joka mahdollistaa proteiinien aktiivisuuden säätelyn proteiinitasolla.
Proteiinien silmukointi -domeenit voidaan jakaa kolmeen eri luokkaan, joista kahta, inteiinejä ja bakteerien inteiinin-kaltaisia (bacterial intein-like, BIL) domeeneja, on tutkittu tässä työssä. Inteiinit ovat yksisoluisista eliöistä löytyviä autokatalyyttisiä proteiini-domeeneja, jotka silmukoituvat irti esiproteiinista liittäen samalla vapautuvat päät yhteen peptidi-sidoksella. Inteiineistä ei tiedetä olevan hyötyä, muttei haittaakaan, isäntäorganismeilleen. Niitä voidaan kuitenkin hyödyntää useissa bioteknologian, biokemian ja biolääketieteen sovelluksissa, sillä ne mahdollistavat post-translationaalisen proteiinin muokkauksen. Suuri osa sovelluksista perustuu proteiinien trans-silmukointiin, joka on halkaistujen inteiinien välittämä proteiinien ligaatio -reaktio. BIL-domeenit voivat myös silmukoitua mutta niiden pääasiallinen tehtävä on katkaista viereinen proteiini irti. Päinvastoin kuin inteiinit, BIL-domeenien uskotaan olevan tärkeitä isäntäorganismeilleen mutta niille ei ole kehitetty bioteknologisia sovelluksia.
Tässä työssä muokattiin uusia halkaistuja inteiinejä sekä tutkittiin näiden bioteknologisten sovellusten kannalta tärkeitä ominaisuuksia in vivo sekä in vitro. Työssä kuvataan uusia aktiivisia halkaistuja inteiinejä, joista muutamalla on sovellusten kannalta erityisen lupaavia ominaisuuksia. Lisäksi työ lisäsi tietämystä halkaistuja inteiinejä kehittäessä huomioitavista seikoista.
Työssä ratkaistiin ensimmäinen BIL-domeenin kolmiulotteinen rakenne NMR-spektroskopian avulla. Tämä vahvisti näiden rakenteellisen homologian inteiinien kanssa sekä auttoi suunnittelemaan proteiinien ligaatioon soveltuvia halkaistuja BIL-domeeneja. Työssä osoitettiin, että halkaistujen BIL domeenien avulla on teoriassa mahdollista ratkaista inteiinien reaktiomekanismista juontuva rajoitus kohdeproteiineille, vaikka reaktion tehokkuutta tulisikin parantaa.
Kolmantena osuutena työssä kuvataan inteiini-välitteinen vaihtoehtoinen proteiinien silmukointi (intein-mediated protein alternative splicing, iPAS). Rakennetutkimukset osoittivat reaktion johtuvan kolmiulotteisesta domeenien uudelleenjärjestäytymisestä. Ilmiö voitiin toistaa useilla eri inteiineillä sekä eri kohdeproteiineilla, mukaan lukien eräs luonnollisista isäntäproteiineista. Lisäksi iPAS:n osoitettiin mahdollistavan proteiinien aktiivisuuden häirinnän sekä pelastamisen. Näitä havaintoja voidaan hyödyntää uusien työkalujen kehittämisessä ja niillä voi olla merkitystä inteiinien biologisen merkityksen kannalta
